[发明专利]一种基于定制的纳米孔直接RNA测序逆转录接头检测全长非poly(A)转录本的方法

权利要求书

1.一种基于Oxford Nanopore Technologies的序列特异性直接RNA测序文库构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）总RNA的提取和质量控制；（2）从总RNA中去除rRNA和质量控制；（3）序列特异性逆转录接头ssRTA的设计、构建和质量控制；（4）基于Oxford Nanopore Technologies的直接RNA测序文库构建；（5）序列特异性RNA的检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述总RNA的提取和质量控制包括以下步骤：

将毛竹实生苗处理洁净；

用TIANGEN RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA试剂盒提取样本总RNA；

用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA样本降解程度；

用Qubit荧光计精确定量总RNA样本；

用Nanodrop 2000c分光光度计检测总RNA样本纯度，以A 260/280和A260/230表征；

用Agilent 2100生物分析仪测定总RNA样本RIN值，用RIN值 8.0的样本进行后续实验。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述从总RNA中去除rRNA和质量控制包括以下步骤：用RiboMinus^TM Plant kit for RNA-seq从总RNA样本中去除rRNA，得到Ribo- RNA样本；用1.0%琼脂糖凝胶电泳（6V/cm）检测去除rRNA效果。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）所述序列特异性逆转录接头ssRTA的设计、构建和质量控制包括以下步骤：

ssRTA的设计：合成2条引物：

SEQ ID NO.1: 5’ - /PHOS/ GGCTTCTTCTTGCTCTTAGGTAGTAGGTTC - 3’；

SEQ ID NO.2:

5’ - GAGGCGAGCGGTCAATTTTCCTAAGAGCAAGAAGAAGCCNNNNNNNNNN - 3’，下划线部分为2条引物20 bp的互补区域；

ssRTA的构建：将2条引物干粉用无菌的去离子水溶解，等体积混匀，置于PCR仪95℃保持10 min，然后以0.1℃/s的速度缓慢退火至30℃；

ssRTA的质量控制：取5 μL制备好的ssRTA，用PCR仪在98℃孵育2 min，后立即置于冰上，然后用Nanodrop 2000c分光光度计测定孵育前后的ssRTA在260 nm处吸光值的变化。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）所述基于Oxford NanoporeTechnologies的直接RNA测序文库构建，包括以下步骤：

用快速连接缓冲液和T4 DNA连接酶，将序列特异性逆转录接头ssRTA连接至Ribo- RNA末端；

用SuperScript III逆转录酶逆转录合成cDNA第一链；

用直接RNA测序试剂盒和T4 DNA连接酶将测序接头连接至待测RNA样本末端；

用R9.4.1测序芯片承载文库，在MinION MK 1B设备上测序，用MinKNOW软件控制直接RNA测序进程。

6.一种利用权利要求1所述方法构建得到的文库在不具备3’ Poly（A）结构的RNA的全长单分子直接测序中的应用。