[发明专利]一种基于定制的纳米孔直接RNA测序逆转录接头检测全长非poly(A)转录本的方法

说明书

本发明名公开了一种基于Oxford Nanopore Technologies的序列特异性直接RNA测序文库构建方法及应用，属于三代高通量测序技术领域。其构建方法为：总RNA的提取和质量控制；从总RNA中去除rRNA和质量控制；设计序列特异性逆转录接头的设计、构建和质量控制；基于Oxford Nanopore Technologies的直接RNA测序文库构建；序列特异性RNA的检测。本方法重新设计ssRTA并将其应用于基于Oxford Nanopore Technologies的直接RNA测序文库，主要应用于测定不带ploy(A)尾的线性转录本，这是以往任何流程无法做到的。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于Oxford Nanopore Technologies的序列特异性直接RNA测序文库构建方法及应用。

背景技术

基于Oxford Nanopore Technologies的直接RNA测序是目前唯一能够直接对天然的RNA分子进行全长单分子测序的技术，其标准文库构建流程是先通过将含有Oligo d(T)的逆转录接头（RTA）连接至所有3’末端具备Poly(A)结构的待测RNA分子，接着进行逆转录生成cDNA第一链，然后将测序接头（RMX）连接至RTA末端后完成文库构建，具有超长读长、单分子实时测序、直接读取RNA分子天然碱基修饰信息等特点。但局限于RTA的序列，目前的方法仅能够对3’末端具备Poly(A)结构的RNA分子测序。

本发明基于Oxford Nanopore Technologies直接RNA测序技术，设计开发了序列特异性逆转录接头（ssRTA），实现了专门针对不具备3’ Poly（A）结构的RNA进行全长单分子直接测序，丰富了直接RNA测序所能检测到的转录本的种类。

发明内容

本发明提供了一种基于Oxford Nanopore Technologies的序列特异性直接RNA测序文库构建方法及应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种基于Oxford Nanopore Technologies的序列特异性直接RNA测序文库构建方法及应用，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）总RNA的提取和质量控制；（2）从总RNA中去除rRNA和质量控制；（3）序列特异性逆转录接头（ssRTA）的设计、构建和质量控制；（4）基于Oxford Nanopore Technologies的直接RNA测序文库构建；（5）序列特异性RNA的检测。可选地，所述总RNA样本来源于植物、动物或人。

上述步骤（1），总RNA的提取和质量控制包括：

将毛竹实生苗处理洁净，如图1所示。

进一步的，用TIANGEN RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA试剂盒提取样本总RNA。

更进一步的，用1.0%琼脂糖凝胶电泳（6V/cm）检测总RNA样本降解程度，如图2所示。

更进一步的，用Qubit荧光计精确定量总RNA样本。

更进一步的，用Nanodrop 2000c分光光度计检测总RNA样本纯度，以A 260/280和A260/230表征。

更进一步的，用Agilent 2100生物分析仪测定总RNA样本RIN值，用RIN值 8.0的样本进行后续实验，如图3所示。

上述步骤（2），从总RNA中去除rRNA和质量控制包括：

用RiboMinus^TM Plant kit for RNA-seq（ThermoFisher, Cat. No. A1083808）从总RNA样本中去除rRNA，得到Ribo- RNA样本。

进一步的，用1.0%琼脂糖凝胶电泳（6V/cm）检测去除rRNA效果，如图4所示。