[发明专利]一种利用RNA-seq技术构建EST-SSR标记的方法与应用

说明书

本发明涉及分子标记技术领域，尤其涉及一种利用RNA‑seq技术构建EST‑SSR标记的方法与应用，包括如下步骤：利用RNA‑seq技术，构建RNA‑seq序列文库；将RNA‑seq序列文库中获得的片段进行组装，得到转录本；利用Misa软件对原生地样本转录本进行SSR预测和鉴定，得到SSR位点；设计SSR位点的引物，得到SSR引物对；利用blast软件将SSR引物对分别与入侵地样本转录本和原生地样本转录本进行序列相似比对，得到电子模拟PCR扩增片段，筛选片段大小不一致的标记，为EST‑SSR标记，最后进行PCR实验验证，分析这些标记在紫茎泽兰群体中的遗传多态性。

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，尤其涉及一种利用RNA-seq技术构建EST-SSR标记的方法与应用。

背景技术

紫茎泽兰(Ageratina adenophora Spreng)属菊科泽兰属多年生亚灌木草本植物，原产于墨西哥等南美地区，上世纪40年代被作为观赏植物引入到欧洲，现在已成为一种世界性的恶性杂草，是典型的入侵植物，称作是植物界的“杀手”，造成了巨大的经济损失和生态环境破坏。在我国，紫茎泽兰已成为第一号入侵植物，在云南、贵州、四川、广西、西藏等地造成严重危害。因此，解析紫茎泽兰群体遗传多样性和遗传结构，以明确其入侵扩张的路线和途径，弄清其入侵定植分子机制，对有效防治和治理紫茎泽兰入侵具有重要意义。SSR等分子标记是开展植物群体遗传多样性和群体结构研究的不可或缺的重要工具。但目前，紫茎泽兰的分子生物学研究还比较薄弱，可用的分子标记资源比较少，现有技术利用紫茎泽兰的基因组探查序列开发了部分核基因组的SSR标记，但其多态性不太好，这限制了紫茎泽兰入侵机制研究的深入。

转录组测序(RNA-seq)技术是利用高通量测序技术对某一状态下的组织或者细胞中的RNA进行深度测序的技术，是一种在转录组水平上高通量、低成本分析基因表达差异的有效手段。同时，对于参考基因组未知的物种，RNA-seq技术也可以高效率、高通量、低成本地获得大量的转录本信息和资源。但是，到目前为止，现有技术中并未发现将RNA-seq技术应用于对紫茎泽兰的研究中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用RNA-seq技术构建EST-SSR标记的方法与应用。本发明构建得到的EST-SSR标记的方法，共鉴定得到1847个多态性紫茎泽兰的EST-SSR标记，是目前最大的紫茎泽兰的EST-SSR数据集。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种利用RNA-seq技术构建EST-SSR标记的方法，包括如下步骤：

(1)利用RNA-seq技术，构建RNA-seq序列文库；

(2)将RNA-seq序列文库中获得的片段进行组装，得到转录本；

(3)利用Misa软件对原生地样本转录本进行SSR预测和鉴定，得到SSR位点；

(4)对步骤(3)得到的SSR位点设计引物，得到SSR引物对；

(5)利用blast软件将步骤(4)得到的SSR引物对分别与入侵地样本转录本和原生地样本转录本进行序列相似比对，得到电子模拟PCR扩增片段，筛选片段大小不一致的标记为EST-SSR标记；

步骤(2)所述的转录本包括原生地样本转录本和入侵地样本转录本。

作为优选，步骤(2)所述的组装利用Trinity软件进行。

作为优选，步骤(2)所述的组装时的参数设置为：rinity.pl-seqType fq-JM50G\-left sample1_1.clean.fastq\-right sample1_2.clean.fastq\-jaccard_clip-CPU 6-SS_lib_type FR。