[发明专利]一种黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的高效表达方法

权利要求书

1.一种黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的高效表达方法，其特征在于，按照先后顺序包括以下步骤：

(1)取黑曲霉DY-2015斜面菌种，接种灭菌的PDA培养基培养，收集菌丝体，置于液氮中研磨，取细粉，加入缓冲液，溶解后，离心，取上清液，抽提，上清液加NaAc，再加无水乙醇，混匀后置于冰上，离心，沉淀用冰冷乙醇洗涤两次，置于超净工作台中吹干，用20μL灭菌水溶解，用Nanodrop2000测定DNA浓度；

(2)设计引物，F：5’-ATGCAGACTCTCCTTGTGAG-3’；R：5’-TCACTGCATGGAAGCATAATG-3’，以步骤1提取的黑曲霉DY-2015基因组DNA为模板，进行PCR扩增；

(3)根据毕赤酵母密码子偏好性，优化黑曲霉DY-2015的葡萄糖氧化酶基因dy-god，用高频率密码子替代低频率密码子，调整密码子适应指数指数在0.8以上，为了后续基因工程操作方便，在序列中剔除了EcoRI、BamHI、BglII、XbaI和Sac I等限制性内切酶酶切位点，并修改可能的提前终止序列，优化后的基因命名为ts-god，并连接于毕赤酵母表达载体pPICzaA的多克隆位点EcoRI和Xba I，连接产物转化大肠杆菌top10感受态细胞，经过含抗生素zeocin的LB平板筛选，获得重组表达载体pPIC-god；

(4)从NCBI下载蛋白质二硫键异构酶基因pdi序列通过在线软件优化设计后进行全合成，连接于pGAPzA表达载体的EcoRI和NotI酶切位点，构建好的载体命名为pGAP-pdi，pGAP-pdi质粒用BglII和BamHI双酶切，回收大片段，与BamHI单酶切的pPIC-god载体连接，转化大肠杆菌top10感受态细胞，经过抗生素zeocin筛选，获得重组质粒，串联表达载体命名为pPIC-god-pdi；

(5)取重组质粒用线性化然后用PCR产物纯化试剂盒纯化，线性化的质粒溶于灭菌ddH₂O中电泳检查线性化质粒纯度，并用Nanodrop2000测定浓度，接种毕赤酵母x33单菌落于10mLYPD培养基中，30℃、250rpm振荡培养12hr，转接50mL YPD中，继续培养至对数生长期，10,000rpm离心5min，用灭菌水和1M冰冷山梨醇洗涤，制备毕赤酵母x33感受态细胞，将线性化DNA与80μL感受态细胞混匀，置于电击杯中，2000V、5ms电击，电击后，立即加入1mL冰冷的1M山梨醇，30℃恢复培养3hr，转化后的细胞涂布于含zeocin的YPDS平板培养基，30℃培养3-4d；

(6)采用邻-联茴香胺分光光度法，在GOD的作用下，葡萄糖和氧反应，生成的过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在辣根过氧化物酶的作用下，生成水和红色的氧化型邻联茴香胺，通过测定反应中颜色的变化进而计算出葡萄糖氧化酶的活性；

(7)挑取单菌落，接种5mL YPD液体培养基，28℃250rpm振荡培养24h，转接到500mL YPD培养基，相同条件下培养12h，将种子液接种到30升发酵罐中，发酵罐中含有10L已灭菌基础培养基，30℃400rpm培养，基础培养基培养24h后，发酵液相对溶氧浓度上升接近100％，表明碳源耗尽，开始补料阶段，补料为50％灭菌甘油，待湿菌重达到300g/L以上时，停止补料，使菌体饥饿1-2h，以耗尽碳源。然后开始甲醇诱导阶段，每升培养基每min流加甲醇0.2mL，3h以后提高到每min流加甲醇0.5mL，每升甲醇中添加PTM1微量盐4.35mL、0.35gα-酮戊二酸、10mM精氨酸。发酵过程中通过氨水调节pH值，确保pH在5.5～6.0之间。通过转速调节，确保相对溶氧在20％以上。每12h测定湿菌重和酶活性的变化。

2.根据权利要求1所述的一种黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的高效表达方法，其特征在于，PDA培养基：去皮马铃薯200g，加水800mL，煮沸30min，过滤，上清液加葡萄糖20g，定容到1L，高压灭菌；LB培养基：2％胰蛋白胨、1％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0；低盐LB培养基：2％胰蛋白胨、1％酵母提取物、0.5％NaCl，pH7.0；YPD培养基：1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖，固体平板另外加1.5％琼脂。YPDS培养基：1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖、1.5％琼脂、1M山梨醇。