[发明专利]一种黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的高效表达方法

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种葡萄糖氧化酶的编码基因及其基因工程表达菌株。本发明提供了一种黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的高效巴斯德毕赤酵母表达方法。为了提高重组酶的正确折叠，在工程菌中通过串联载体构建，引入了蛋白质二硫键异构酶pdi基因，帮助蛋白质折叠，提高酶的表达活性。本发明还提供了一种毕赤酵母生产葡萄糖氧化酶的发酵培养基组成及工艺。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的高效表达方法。

背景技术

葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase,GOD,EC 1.1.3.4)是一种重要的工业用酶，在有氧条件下，GOD能够专一性的将葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和过氧化氢。GOD在食品、传感器、医学领域以及畜牧行业中均具有广泛的应用。在食品中，GOD作为抗氧化剂和绿色抗菌剂能够有效抑制好氧菌生长，延长食品货架期；在医学领域，GOD已被广泛用于口腔护理和美白，也被用于建立H₂O₂氧化应激模型进行病理研究。GOD的另外一个重要的应用是葡萄糖的酶生物传感器，原理是将GOD固定于电极上，用电子传递介质来提高酶的氧化还原活性中心与电极表面的电子传递，将酶促反应中反应物的消耗或是产物的生成转换为电信号从而记录下来。

GOD在动物养殖业中也有着广泛的应用。研究表明，在饲料中添加GOD能够降低消化道pH值、提高消化酶活性和营养物质的消化率、改善肠道形态结构。GOD还能够消耗氧气创造利于有益厌氧菌生存的肠道环境，产生的H₂O₂能够抑制大肠杆菌、沙门氏菌等肠道病原菌繁殖，维持肠道微生态系统平衡。GOD还能缓解氧化应激、使畜禽保持健康、提高母畜繁殖性能，进而提高畜禽的生产性能并改善畜产品的品质。

多种动植物和微生物均能产生GOD，目前GOD主要由曲霉和青霉生产。目前，GOD已经能工业化生产，但由于饲料工业的特殊性(如高温制粒)，开发耐热性好的GOD具有非常重要的意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的高效表达方法，按照先后顺序包括以下步骤：

(1)取黑曲霉DY-2015斜面菌种，接种灭菌的PDA培养基培养，收集菌丝体，置于液氮中研磨，取细粉，加入缓冲液，溶解后，离心，取上清液，抽提，上清液加NaAc，再加无水乙醇，混匀后置于冰上，离心，沉淀用冰冷乙醇洗涤两次，置于超净工作台中吹干，用20μL灭菌水溶解，用Nanodrop2000测定DNA浓度；

(2)设计引物，F：5’-ATGCAGACTCTCCTTGTGAG-3’；R：5’-TCACTGCATGGAAGCATAATG-3’，以步骤1提取的黑曲霉DY-2015基因组DNA为模板，进行PCR扩增；

(3)根据毕赤酵母密码子偏好性，优化黑曲霉DY-2015的葡萄糖氧化酶基因dy-god，用高频率密码子替代低频率密码子，调整密码子适应指数指数在0.8以上，为了后续基因工程操作方便，在序列中剔除了EcoRI、BamHI、BglII、Xba I和Sac I等限制性内切酶酶切位点，并修改可能的提前终止序列，优化后的基因命名为ts-god，并连接于毕赤酵母表达载体pPICzaA的多克隆位点EcoRI和Xba I，连接产物转化大肠杆菌top10感受态细胞，经过含抗生素zeocin的LB平板筛选，获得重组表达载体pPIC-god；

(4)从NCBI下载蛋白质二硫键异构酶基因pdi序列通过在线软件优化设计后进行全合成，连接于pGAPzA表达载体的EcoRI和Not I酶切位点，构建好的载体命名为pGAP-pdi，pGAP-pdi质粒用BglII和BamHI双酶切，回收大片段，与BamHI单酶切的pPIC-god载体连接，转化大肠杆菌top10感受态细胞，经过抗生素zeocin筛选，获得重组质粒，串联表达载体命名为pPIC-god-pdi；