[发明专利]一种用于检测HCV 1型耐药突变基因的检测方法及应用

说明书

本发明公开了一种用于检测HCV 1型耐药突变基因的检测方法，并针对1型HCV的NS3区域序列设计了一系列特异性扩增引物组，包括至少一对外引物和至少一对内引物，使用该扩增引物组用于检测HCV 1型耐药突变基因，进行PCR扩增等检测分析时，可确保低浓度样本中HCV基因1a、1b两个亚型扩增成功率100％，并获取更长的目的片段，从而有效保证NS3区域耐药相关突变位点的覆盖率。本发明有利于对低HCV RNA浓度的样品进行检测，灵敏度高。从而可用于辅助分析研究1型HCV基因的耐药突变情况，进而为耐药性临床研究提供参考。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种用于检测HCV 1型耐药突变基因的检测方法及应用。

背景技术

据世界卫生组织估计，全球有1.7亿人感染HCV。在我国健康人群抗HCV阳性率为0.7％～3.1％，约3800万人。直接抗病毒药物(Direct anti-HCV agents,DAAs)主要为HCV病毒非结构蛋白(NS3,NS5A,NS5B)抑制剂，而HCV基因的某些突变会显著降低这种抑制作用。因此随着直接抗病毒药物在国内上市及临床应用，HCV耐药性检测将在临床用药中起到重要的作用。但目前在HCV耐药性检测中，要把耐药基因中的多个耐药相关突变位点通过简单的检测方法进行有效检测较难实现，其难点在于难以得到有效的目的片段，或者是得到的目的片段难以囊括待检的多个突变位点。特别是当样本中目的待测物的浓度很低时，更是难以实现多个突变位点得到精准全面的检测效果。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提供一种用于检测HCV 1型NS3耐药突变基因的检测方法，可在低浓度样本中扩增得到有效覆盖了HCV 1型NS3基因耐药突变位点的目的片段，从而可以在低浓度样本中实现耐药突变位点全面检测，为全面分析HCV 1型的耐药情况提供依据。

实现上述目的的技术方案如下：

一种HCV 1型耐药突变基因的检测方法，包括如下步骤：

(1)获取待测HCV RNA样品；

(2)以待测样本的RNA为模板，采用扩增引物组进行两次RT-PCR扩增；

(3)回收步骤(1)的产物，测序后进行耐药性分析。

在其中一些实施例中，上述耐药性分析为测序结果与HCV1型参考株的序列进行比对，确认耐药相关突变位点是否发生变异。

在其中一些实施例中，上述耐药相关突变位点为第36位的缬氨酸、第41位的谷氨酰胺、第43位的苯丙氨酸、第54位的苏氨酸、第55位的缬氨酸、第56位的酪氨酸、第80位的谷氨酰胺、第122位的丝氨酸、第155位的精氨酸、第156位的丙氨酸、第158位的缬氨酸、第168位的天冬氨酸、第170位的异亮氨酸/缬氨酸和第175位的亮氨酸/甲硫氨酸中的至少一种。

在其中一些实施例中，上述HCV1型参考株为NC_004102和/或AJ238799.1。

在其中一些实施例中，上述扩增引物组包括至少一对外引物和至少一对内引物；所述外引物对的序列如SEQ ID NO.1-SEQID NO.2所示，所述内引物对序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示。

在其中一些实施例中，上述扩增引物组包括至少一对外引物和至少一对内引物；所述外引物对的序列如SEQ ID NO.5-SEQID NO.6所示，所述内引物对序列如SEQ ID NO.7-SEQID NO.8所示。

在其中一些实施例中，上述扩增引物组包括至少一对外引物和至少一对内引物；所述外引物对的序列如SEQ ID NO.1-SEQID NO.2和SEQ ID NO.5-SEQID NO.6所示，所述内引物对序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.7-SEQID NO.8所示。