[发明专利]一种提高红松胚性愈伤组织诱导率的方法

权利要求书

1.一种提高红松胚性愈伤组织诱导率的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

一、将红松球果经预处理后在4～6℃的温度条件下培养28～35d，得到培养后的红松球果；将培养后的红松球果清洗后剥去果鳞，然后进行消毒和冲洗处理，再剥去种皮，继续进行消毒和冲洗处理，得到灭菌后的雌配子体；将灭菌后的雌配子体接种于愈伤组织诱导培养基中，在21～25℃的温度条件下暗培养30～60d，得到培养后的胚性愈伤组织；

二、将培养后的胚性愈伤组织与基础培养基混合，震荡离心，再过滤，得到分散的胚性细胞团，所述培养后的胚性愈伤组织的质量与基础培养基的体积的比为250～750mg：25mL，所述基础培养基的PH为5.8，由mLV和0.2mol·L^-1蔗糖组成；将分散的胚性细胞团置于成熟培养基上暗培养40～60d，得到体胚，所述成熟培养基的PH为5.8，由mLV、0.2mol·L^-1蔗糖、80umol·L^-1ABA和12g·L^-1结冷胶组成。

2.根据权利要求1所述的一种提高红松胚性愈伤组织诱导率的方法，其特征在于步骤一中红松球果的预处理为使用75％的乙醇溶液均匀喷洒。

3.根据权利要求1所述的一种提高红松胚性愈伤组织诱导率的方法，其特征在于步骤一中将培养后的红松球果清洗后剥去果鳞，然后进行消毒和冲洗处理的步骤为：先用70～75％的乙醇溶液处理1～2min，然后用无菌水冲洗3～5次，再用质量浓度为10％的次氯酸钠溶液处理15min，继续用无菌水冲洗3～5次。

4.根据权利要求1所述的一种提高红松胚性愈伤组织诱导率的方法，其特征在于步骤一中将红松球果剥去种皮，继续进行消毒和冲洗处理的步骤为：先用3％的双氧水消毒8min，再用无菌水冲洗3～5次。

5.根据权利要求1所述的一种提高红松胚性愈伤组织诱导率的方法，其特征在于步骤一中所述的愈伤组织诱导培养基由mLV培养基、4g·L^-1结冷胶、500mg·L^-1L-谷氨酰胺、30g·L^-1蔗糖、0.5g·L^-1水解酪蛋白、2mg·L^-1NAA和1.5mg·L^-1 6-BA组成。

6.根据权利要求5所述的一种提高红松胚性愈伤组织诱导率的方法，其特征在于所述mLV培养基使用前先将pH调节至5.8，然后在121℃的温度条件下灭菌20min；所述L-谷氨酰胺的添加方式为：待mLV培养基灭菌后冷却至55～60℃时，使用孔隙为0.22μm的滤器将L-谷氨酰胺过滤后加入到mLV培养基中。