[发明专利]用于检测HCV 2a亚型耐药突变基因的扩增引物、检测方法及应用

说明书

本发明公开了一种用于检测HCV 2a亚型NS3耐药突变基因的扩增引物、检测方法及应用。所述用于检测HCV 2a亚型NS3耐药突变基因的扩增引物组,包括一对外引物和一对内引物。其用于检测HCV 2a亚型NS3耐药突变基因，进行PCR扩增等检测分析时，可确保低浓度样本中HCV基因2a亚型NS3耐药突变基因的扩增成功率100％，并获取更长的目的片段，从而有效保证NS3区域耐药相关突变位点的覆盖率。本发明有利于对低HCV RNA浓度的样品进行检测，灵敏度高。从而可用于辅助分析研究2a亚型HCV基因的耐药突变情况，进而为耐药性临床研究提供参考。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种用于检测HCV 2a亚型耐药突变基因的扩增引物、检测方法及应用。

背景技术

迄今为止，丙型肝炎病毒(HCV)具有7种基因型和67种亚型，差异很大。HCV基因型(GT)和亚型的差异，以及耐药相关取代(RASs)的存在，均为选择直接作用抗病毒(DAA)治疗方案的关键因素。但是，目前可用的HCV基因分型分析在区分HCV亚型方面存在局限性，并且在不同亚型中的RAS流行率很大程度上是不确定的。

据世界卫生组织估计，全球有1.7亿人感染HCV。在我国健康人群抗HCV阳性率为0.7％～3.1％，约3800万人。直接抗病毒药物(Direct anti-HCV agents,DAAs)主要为HCV病毒非结构蛋白(NS3,NS5A,NS5B)抑制剂，而HCV基因的某些突变会显著降低这种抑制作用。因此，随着直接抗病毒药物在国内上市及临床应用，HCV耐药性检测将在临床用药中起到重要的作用。但目前在HCV耐药性检测中，通过简单的检测方法进行有效检测较难实现，其难点主要在于难以得到有效的目的片段，或者是得到的目的片段难以囊括待检的多个突变位点。特别是当样本中目的待测物的浓度很低时，更是难以实现多个突变位点得到精准全面的检测效果。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提供一种用于检测HCV 2a亚型NS3耐药突变基因的扩增引物组，可在低浓度样本中扩增得到有效覆盖了HCV 2a亚型NS3基因耐药突变位点的目的片段，从而可以实现在低浓度样本中耐药突变位点全面检测，为全面分析HCV 2a亚型的耐药情况及临床用药中起到重要作用。

实现上述目的的技术方案如下：

一种用于检测HCV 2a亚型NS3耐药突变基因的扩增引物组，所述扩增引物组包括一对外引物和一对内引物；所述外引物对的序列如SEQ ID NO.1-SEQID NO.2所示，所述内引物对序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示；或所述外引物对的序列为SEQ ID NO.1-SEQID NO.2所示的反向互补序列，所述内引物对序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示。

一种用于检测HCV 2a亚型NS3耐药突变基因的扩增引物组，所述扩增引物组包括一对外引物和一对内引物；所述外引物对的序列为SEQ ID NO.1-SEQID NO.2所示的反向互补序列，所述内引物对的序列为SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示的反向互补序列；或所述外引物对的序列如SEQ ID NO.1-SEQID NO.2所示，所述内引物对的序列如SEQ ID NO.3-SEQID NO.4所示的反向互补序列。

本发明的目的之一还在于提供一种HCV 2a亚型NS3耐药突变基因的检测方法。

实现上述目的的技术方案如下：

(1)以待测样本的总RNA为模板，采用权利要求1-2任一项所述外引物对进行RT-PCR扩增；

(2)回收步骤(1)的产物测序后进行耐药性分析。

在其中的一些实施例中，上述检测方法还包括如下步骤：

对所述步骤(1)的产物采用权利要求1-2任一项所述内引物对进行RT-PCR扩增，再对该PCR扩增的产物测序后进行耐药性分析。