[发明专利]一种高效降解氨基甲酸乙酯的农杆菌及其应用

说明书

本发明提供一种高效降解氨基甲酸乙酯的农杆菌DL‑DNH01，保藏编号：CGMCCNo.21308。所述农杆菌DL‑DNH01经活化、发酵、制微胶囊过程得到降解制剂。本发明所筛选的DL‑DNH01可用于发酵食品中EC的去除，对氨基甲酸乙酯的降解率达到95％，解决了发酵食品中有毒有害代谢产物超标问题和安全问题，支撑安全发酵食品的优质发展，有效提升酒类饮料和发酵食物的质量品质和安全性；本发明进一步提供了一种使用菌株DL‑DNH01生产制备得到的降解制剂，具有生产成本低、使用方便，去除效果明显，易于从发酵产品体系中移除等优点，适合酒类饮料和发酵食物中EC的去除。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，更具体地说，涉及一种土壤中分离出具有EC 降解活性的农杆菌及其应用，命名为农杆菌DL-DNH01，分类命名为根瘤土壤 杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)。

背景技术

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，EC)是一种具有遗传毒性和较强致癌性的代谢产物，广泛存在于酒精饮料和发酵食品(如腐乳、酱油、乳酪、食醋、泡菜等)中，对食品安全和人体健康有着严重的影响和危害。

发酵食品中的EC主要是由尿素、氨甲酰磷酸、瓜氨酸、焦碳酸二乙酯等含氨甲酰基前体物质与乙醇反应而形成。发酵食品中的EC可通过工艺优化、代谢工程、微生物降解和酶法去除。

其中，微生物降解和酶法去除是利用EC降解酶(或EC前体降解酶)或产相应酶的微生物，直接降解发酵产品中的EC或EC前体物质，比如，脲酶可以将尿素分解为氨和CO2，可有效减少EC生成，在生产过程中利用酸性脲酶控制成品酒中EC含量是最为常用方法。但是由于尿素并不是唯一的形成EC的前体物质，因此该方法难以彻底根除EC的形成。

所以，利用EC降解酶或产相应酶的微生物，直接降解发酵产品中的EC成为更有前景的方法。因为EC水解酶能够将EC降解为乙醇、氨和二氧化碳，从而能够有效的降解EC。

但是由于EC形成机制多而且比较复杂，同时抑制多种形成EC的机制比较困难，难以彻底根除EC前体物质，从而难以彻底消除EC的形成，并且EC形成后由于其结构非常稳定，难以根除，因此应用微生物降解和生物酶法去除成品中已经形成的EC，是一种较为理想的去除方法。

问题在于，目前现有的EC降解菌资源库远远不能满足食品中EC生物降解的实际需求，目前发现的EC降解菌株极少，而且利用微生物实现对EC的降解，机理比较复杂，目前尚未阐释，也进一步影响了微生物来源EC降解酶的分离和应用。

现有技术中胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)应用到中国商业化的白酒中，可降解其51.6％的EC(Appl Biochem Biotechnol,2013:1-13)。来源于L. fermentum的酸性脲酶添加到日本清酒(pH 4.4，17％(v/v)乙醇)中，反应2天后可将酒中的尿素降解到1μg/L以下，从而间接抑制EC的生成，但对已生成的EC去除效果，文章并没有报道(ApplMicrobiol Biotechnol,1990,32(5): 538-543.)。

因此，本发明开展发酵食品中EC的微生物去除技术研究，筛选出EC高效降解微生物菌株是十分必要的，可为减低发酵食品中EC残留提供有效手段，为保障发酵食品安全提供技术支持。

发明内容

针对现有EC降解菌剂对EC降解效果不佳的问题，本发明目的在于提供一株农杆菌DL-DNH01，以及用该农杆菌制备的降解剂。本发明涉及的农杆菌 DL-DNH01采集自陕西宝鸡柳林镇土壤，已于2020年12月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号CGMCC No.21308。保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

利用所述农杆菌DL-DNH01制备降解剂的方法，包括以下步骤：