[发明专利]放大微量DNA并用于多种核酸检测的方法及核酸检测装置

说明书

本发明提供一种连接扩增放大微量DNA并用于下游多种核酸检测的方法，包括：提供DNA样本变性形成单链DNA并经多聚核苷酸激酶处理得到修饰的单链DNA；对所述单链DNA进行保守序列接头连接，以获得第一产物；对所述第一产物进行纯化处理以得到第二产物；对所述第二产物进行扩增处理以得到第三产物；使用所述第三产物进行下游核酸检测。此外，本发明还提供一种核酸检测装置。本发明提供技术方案，实现将微量DNA扩增至几百纳克甚至微克级别以满足下游核酸检测，确保在进一步核酸检测中能够有足量的DNA投入，提升核酸检测的准确性；并且操作简单，无需用到特殊的酶和原材料即可实施，有效降低了实施的总体成本。

【技术领域】

本发明涉及基因测序核酸检测技术领域,具体涉及一种放大微量DNA并用于多种核酸检测的方法及核酸检测装置。

【背景技术】

目前的核酸检测技术主要是基于DNA PCR扩增技术。PCR扩增技术是聚合酶链式反应技术的英文缩写，即聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)。PCR技术是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR反应需要的模板DNA投入量从10ng-100ng起。但PCR反应由于需要特定的引物进行扩增，所产生的产物为定向产物，而非所有DNA模板统一扩增。并且DNA模板量低也会影响检测结果的准确性。

液态活检技术中一个重要的组成部分就是游离DNA的检测。游离DNA含量因人而异，但总体含量较低，一般10ml血液中含量在几纳克到几十纳克之间。检测游离DNA主要方法有下一代测序(Next-generation Sequencing，NGS)测序，微滴式数字PCR(DropletDigital PCR,ddPCR)，实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time，PCR)，以及基于飞行质谱处理等。NGS测序的优势是通量高、检测灵敏，但检测时间周期长且价格高，并且需要专业的生物信息分析。ddPCR技术检测灵敏度高但通量较低。qPCR技术则检测方法简便但同样检测通量低。飞行质谱则是多重PCR+单碱基延伸+核酸飞行质谱检测。ddPCR，qPCR，PCR，以及基于飞行质谱技术对DNA的含量要求较高，也需要有一定的量的DNA才能满足其需要。更多的核酸检测方法如芯片检测、PCR检测等还难以应用到游离DNA这类微量DNA的检测。

现有微量DNA放大技术主要来源于单细胞测序。主要技术有：1.PEP，即引物延伸预扩增(Primer Extension Preamplification，PEP)，直接采用随机引物进行扩增，主要缺陷是产物量低，随机引物会引入到下一阶段导致检测结果产生偏差。2.DOP-PCR，即简并寡核苷酸引物PCR(Degenerate Oligonucleotide Primed，DOP)PCR，使用随机引物对所有DNA进行扩增后再特异性扩增，是在PEP的技术基础上改进一步。主要缺陷是当模板量低时，扩增会有偏向性。并且聚合酶和扩增引物需要进行优化。3.LM-PCR，即连接介导的PCR反应(Ligation-mediated Polymerase Chain Reaction，LM-PCR)，是针对打断的双链DNA进行接头连接，再使用接头相关引物进行扩增的技术。主要缺陷是；操作复杂繁琐，步骤较多容易使模板DNA丢失。并且不能用于甲基化扩增。4.pWGA，即基于引物酶的全基因组扩增(Primer-based Whole Genomeamplification，pWGA)，通过使用噬菌体T7 gp4酶使双链DNA变性再通过多点的引物对基因组进行扩增。主要缺陷是成分复杂，引入多种酶和试剂，保真度较低。5.MDA，即多次位移放大扩增(Multiple Displancement Amplification，MDA)，引物与Phi29 DNA聚合酶协作扩增目的基因片段。主要缺陷是需要大量的模板，当模板量低时，产物扩增偏向性会较大。6.MALBAC，即多次退火环状循环扩增(Multiple Annealingand Looping-based Amplification Cycles，MALBAC)，一部分引物进行随机扩增，一部分引物形成环形产物以阻止过度扩增。主要缺陷是当模板量低时很容易产生偏向性，以及获得不到特异性产物。