[发明专利]一种将DNA片段随机插入枯草芽孢杆菌染色体的方法及其应用有效
| 申请号： | 202110355936.6 | 申请日： | 2021-04-01 |
| 公开（公告）号： | CN113025641B | 公开（公告）日： | 2023-05-23 |
| 发明（设计）人： | 闫新;叶斌;成明根 | 申请（专利权）人： | 南京农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/75 | 分类号： | C12N15/75;C12N15/67;C12N1/21;C12N15/55;C12R1/125 |
| 代理公司： | 南京天华专利代理有限责任公司 32218 | 代理人： | 傅婷婷;徐冬涛 |
| 地址： | 211225 江苏省南京市溧*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 dna 片段 随机 插入 枯草 芽孢 杆菌 染色体 方法 及其 应用 | ||
1.一种用于把目标DNA片段随机插入枯草芽孢杆菌染色体的组合物，其特征在于，由以下两组分组成：
组分A：质粒pUSIGH，其序列如SEQ ID NO.2所示；
组分B：质粒pTMCZ，其序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的组合物在把目标DNA片段随机插入枯草芽孢杆菌染色体中的应用。
3.权利要求1所述的组合物在构建目的基因被随机插入染色体的枯草芽孢杆菌基因工程菌中的应用。
4.一种枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于将权利要求1所述的组合物共同转化枯草芽孢杆菌168，经氯霉素和壮观霉素筛选得到。
5.权利要求1所述的组合物在优化目标蛋白在枯草芽孢杆菌中表达水平中的应用。
6.一种把目标DNA片段随机插入枯草芽孢杆菌染色体的方法，其特征在于，包括：将表达目标DNA的表达盒与权利要求1中所述的质粒pTMCZ的扩增片段进行融合，制备转座子元件LF-Pzeo-ITR1-Transcription terminator-Cm-目标DNA-ITR2-Zeo-RF融合片段，其中LF-Pzeo -ITR1-Transcription terminator-Cm片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，ITR2-Zeo-RF片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，将该转座子元件或含有该转座子的质粒与权利要求1中的质粒pUSIGH共同转化到枯草芽孢杆菌菌株168中，通过氯霉素和壮观霉素抗性筛选得到菌株PDZCM-pUSIGH，经过添加木糖诱导菌株PDZCM-pUSIGH后涂布于含有氯霉素和零霉素的LB平板，获得目标DNA片段随机插入枯草芽孢杆菌染色体的克隆。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的转座子元件通过化学合成或融合PCR制备。
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