[发明专利]一种将DNA片段随机插入枯草芽孢杆菌染色体的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种将DNA片段随机插入枯草芽孢杆菌染色体的方法及其应用。一种组合物，由选自转座子元件或含有该转座子元件的质粒和质粒pUSIGH组成。该组合物在把目标DNA片段随机插入枯草芽孢杆菌染色体中的应用。将组合物共同转化到枯草芽孢杆菌中后，转座子元件或含有该转座子元件的质粒会通过同源重组将转座子元件整合到宿主染色体中，pUSIGH可在宿主内正常独立复制。用木糖诱导pUSIGH上的转座酶基因表达，在转座酶的作用下转座子随机插入到染色体上；进而可筛选出目标蛋白表达水平较高的克隆。

技术领域

本发明属于生物高技术领域，公开了一种将DNA片段随机插入枯草芽孢杆菌染色体的方法及其应用。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是重要的重组蛋白表达宿主，其具有安全好、发酵成本低、分泌蛋白能力强及生长迅速等优点。在构建表达菌株时，可利用多拷贝质粒携带目标基因，或者将目标基因整合于宿主染色体上。这两种方式分别被称为质粒型表达和染色体整合型表达。质粒型表达的缺点是稳定性差且通常携带抗性基因，优点是基因拷贝数高。染色体整合型表达稳定性好且无抗性基因问题，但这种方式的缺点是基因拷贝数较少、目标蛋白产量较低，需要通过各种手段优化表达水平。

整合型表达方式中，提高蛋白产量的方法之一是改变目标基因在染色体的位置(Englaender et al..ACS Synth Biol.6:710-20.Doi:10.1021/acssynbio.6b00350.Sauer et al..2016.ACS Synth Biol.9:942-46.Doi:10.1021/acssynbio.6b00065)。依据是位置效应，即基因的表达水平受整合位置影响。位置效应的原因主要有三个。一是剂量效应，位于复制起始位点oriC附近的基因在染色体复制回合中具有更多的拷贝数，从而具有相对较高的表达水平(Block et al..2012.Nucleic AcidsRes.18:8979-92.Doi:10.1093/nar/gks694)。二是大多数基因的转录方向与DNA复制的方向是相同，从而与DNA复制的冲突(Bryant et al..Nucleic Acids Res.18:11383-92.Doi:10.1093/nar/gku828)。三是上游启动子的转录加强效应。总之，在采用染色体整合型表达方式时要为目标基因挑选合适的整合位置。

挑选位置的常用策略是将目标基因随机插入到染色体不同位置，然后筛选表达水平高的克隆。该策略可通过转座元件实现，即将目标基因置于转座子中，利用转座子随机插入的特性将目标基因随机插入染色体不同位置。在枯草芽孢杆菌中，常用的转座子系统是pMarA(Breton et al..2006.Appl Environ Microbiol.72:327-333.Doi:10.1128/AEM.72.1.327-33.)。然而，该系统的不足之处是在50℃条件下进行筛选且存在多拷贝插入现象；50℃可能会失活温度敏感性蛋白，多拷贝插入则导致假阳性。因此，需要为枯草芽孢杆菌建立更高效的染色体随机插入的方法。

发明内容

针对枯草芽孢杆菌中现有的染色体随机插入方法存在筛选温度较高和假阳性问题，本发明建立一种新的将DNA片段随机插入枯草芽孢杆菌染色体的方法，实现在常温条件下将DNA片段以单拷贝形式高效随机插入枯草芽孢杆菌染色体，并证明该方法可用于优化重组蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达水平。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种用于把目标DNA片段随机插入枯草芽孢杆菌染色体的组合物，由以下两组分组成：

组分A：质粒pUSIGH，质粒pUSIGH全序列如SEQ ID NO.2所示；质粒pUSIGH用于控制转座酶的表达，从而控制转座子的随机插入。