[发明专利]一种含有eGFP标记和潮霉素抗性双元载体的构建方法

说明书

本发明公开了一种含有eGFP标记和潮霉素抗性双元载体的构建方法，以载体pCAMBIA3301为基础构建潮霉素抗性双元质粒，与含有eGFP标记基因的表达盒无缝克隆连接。摒弃了传统转化子鉴定中基因组PCR过程，采取了更为直观高效的绿色荧光标记和潮霉素抗性的鉴定方式。降低了实验成本，同时避免了使用苯酚、氯仿、异戊醇、液氮等危险试剂，具有更高的安全性和可靠性。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种含有eGFP标记和潮霉素抗性双元载体的构建方法。

背景技术

根癌农杆菌介导转化法：根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti(Tumourinducing)质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA(Transf erring DNA)，农杆菌通过AS(乙酰丁香酮)诱导后进入细胞后，可将T-DNA插入到真菌基因组中，并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导以植物和真菌为代表真核生物转基因的理论基础。

农杆菌转化必须使用双元载体系统(二元系统)或共整合系统，除Ori序列等载体基本骨架外，均具备完整的Vir基因区、T-DNA及左右边界，以供核酸内切酶特异性识别并切割。双元载体分别由含有T-DNA的多功能克隆质粒和含有Vir区的Ti衍生质粒构成，均位于农杆菌内，前者负责在大肠杆菌和农杆菌内进行复制和运载T-DNA边界内的DNA序列(目的基因及标记基因)，Ti衍生质粒提供反式毒性区功能，催动T-DNA的转移。共整合系统主要由同时含有转移区和毒力区的Ti质粒和大肠穿梭质粒构成，Ti质粒位于农杆菌内，穿梭质粒位于大肠杆菌，通过与大肠穿梭质粒发生同源重组将外源基因整合到Ti质粒的T-DNA区形成共整合质粒，使之成为T-DNA的一部分。

发明内容

本发明针对现有ATM法转化真菌后必须提取基因组繁琐的阳性鉴定问题，提出一种含有eGFP标记和潮霉素抗性双元载体的制备方法，摒弃了传统转化子鉴定中基因组PCR过程，采取了更为直观高效的绿色荧光标记和潮霉素抗性的鉴定方式，具有方便、成本低、用时少、安全性高、可靠性强的特点。

为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种含有eGFP标记和潮霉素抗性双元载体的构建方法，以载体pCAMBIA3301为基础构建潮霉素抗性双元质粒，与含有eGFP标记基因的表达盒无缝克隆连接。

具体的所述的含有eGFP标记和潮霉素抗性双元载体的构建方法，包括以下步骤：

1)构建潮霉素表达盒与经EcoR I、xbal酶切后线性化pCAMBIA3301质粒连接得到潮霉素抗性双元质粒；

2)以pCT74为模板扩增得到，构建含有eGFP标记基因的表达盒；

3)将步骤1)的潮霉素抗性双元质粒与步骤2)含eGFP标记基因的表达盒无缝克隆连接。

进一步的，以质粒pAN7-1为模板，利用如SEQ ID NO.1～2所示引物获得潮霉素表达盒gpdA-HygR-trpC。

进一步的，所述的含eGFP标记基因的表达盒包括gpdA-eGFP-trpC和glaA-eGFP-trpC。

进一步的，所述的表达盒gpdA-eGFP-trpC中，获得各片段的引物依次如SEQ IDNO.3～8所示。

进一步的，所述的表达盒glaA-eGFP-trpC中，获得各片段的引物依次如SEQ IDNO.9～14所示。

本发明的有益效果为：