[发明专利]鉴别呼伦贝尔短尾羊纯合杂合子的PCR-RFLP方法及引物

说明书

本发明提供了一种鉴别呼伦贝尔短尾羊纯杂合个体的PCR‑RFLP方法及引物，利用Bci T130I限制性内切酶的特异性识别位点进行基因分型，以样本基因组DNA为模板，扩增呼伦贝尔短尾羊Brachyury/T基因，所扩增基因长度为203bp。上游引物所在Brachyury/T基因的95879504位点至95879486位点，下游引物位置为95879302位点至95879323位点；将PCR产物进行纯化后使用Bci T130I进行酶切；对酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳观察结果，有着明显两条条带为纯合呼伦贝尔短尾羊，明显三条条带的为杂合呼伦贝尔短尾羊。本发明操作简便、反应不需要额外的分析步骤，并通过条带数量准确分型出纯、杂合基因型，酶切体系和时间不会引起Bci T130I酶的星活性。

技术领域

本发明属于绵羊分子育种鉴定领域，具体涉及一种鉴别呼伦贝尔短尾羊纯合杂合子的PCR-RFLP鉴别方法及引物。

背景技术

我们利用基因组重测序技术筛选到与脊椎发育相关的T/Brachyury基因作为候选基因，并确定在呼伦贝尔短尾羊群体中存在稳定T/Brachyury基因c.G334T突变，并证明与“短尾”这一具有经济价值的性状相关。绵羊分子育种中：纯合子个体相对于杂合子后代性状表现稳定，通过将种群中纯合个体筛选并作为主要繁育对象。而传统方法主要采用sanger测序法、Taqman探针基因分型鉴定为基础，与具有商业价值相关性状的SNP位点关联作为依据，利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

使用传统方法，具有用时长、成本高、通量低、DNA模板的组成或二级结构有时引起DNA聚合酶不正常终止等缺点。

发明内容

本发明为克服传统sanger测序法操作较为繁琐，用时长等缺点，提供了一种鉴别呼伦贝尔短尾羊纯合杂合子的PCR-RFLP方法及引物，相较于原来的技术，基于限制性内切酶结果的条带数量分析，具有极高的敏感性，可以检测出呼伦贝尔短尾羊T/Brachyury基因c.G334T突变纯合子、杂合子的个体差异，并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受实验环境的局限。

本发明的目的通过以下技术方案实现的：

一种鉴别呼伦贝尔短尾羊纯杂合个体PCR-RFLP法所用引物，其特征在于：所述引物序列如下：

BrachyuryFX-F:5’-TGCGCCCCTTCCTTTTCAG-3’

BrachyuryFX-R:5’-GGGGGAGTCGGGGTGGATGTAG-3’。

一种鉴别呼伦贝尔短尾羊纯杂合个体的PCR-RFLP方法，其特征在于：其操作步骤为：

步骤1)以样本基因组DNA为模板扩增Brachyury/T基因的区间序列得到扩增基因片段，所用引物为权利要求1所述序列引物；

步骤2)使用琼脂糖凝胶回收试剂盒或PCR产物回收试剂盒对步骤1)所得扩增产物进行回收纯化；

步骤3)对步骤2)所得纯化产物进行酶切；

步骤4)将步骤3)所得酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳并观察结果。

所述步骤1)扩增基因片段长度为203bp，PCR反应条件为：95℃3min；95℃15s，65℃15s，72℃12s，共30个循环，72℃5min。