[发明专利]一种快速检测肠杆菌β-内酰胺酶的方法

说明书

本发明提供了一种快速检测肠杆菌β‑内酰胺酶的方法，以检测肠杆菌科细菌产生的碳青霉烯酶(IMP、VIM、OXA)、超广谱β‑内酰胺酶(TEM和CTX‑M)和AmpC(CMY‑2)。所述方法包括挑取单个菌落分散在缓冲液中，超声处理后经超滤离心，然后用胰蛋白酶进行膜上酶切，得到肽段；基于特异性肽段及同位素标记的特异性肽段的信息建立PRM(parallelreaction monitoring)靶向蛋白组方法，采用纳升液相及高分辨质谱联用检测肽段；用Skyline软件处理数据，根据所得参数判断β‑内酰胺酶是否阳性。

技术领域

本发明涉及病原微生物及耐药微生物检测领域，具体地说，涉及一种基于LC-MS/MS的快速检测肠杆菌耐药酶的方法及应用。

背景技术

随着碳青霉烯类及β-内酰胺类抗菌药物在临床的广泛应用，细菌耐药形势日趋严峻。多重耐药和泛耐药菌株日益增多以及耐药酶的快速传播给临床抗感染治疗带来了极大的挑战，已成为严重的全球公共卫生问题。在2017年世界卫生组织(World HealthOrganization,WHO)发布的新型抗生素研发重点病原体清单中，碳青霉烯类药物耐药(CRE)、产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)肠杆菌科处于极为重要(1类重点)的位置。

β-内酰胺酶是一类使β-内酰胺类抗生素失活，导致抗菌活性无效的耐药酶。根据β-内酰胺酶的一级结构，Ambler将其分为4类：А、B、C和D。在所有的β-内酰胺酶中，碳青霉烯酶最受关注；А和D类碳青霉烯酶是丝氨酸型水解酶，如KPC和OXA。B类碳青霉烯酶是金属水解酶，如NDM、IMP、VIM等。超广谱β-内酰胺酶(ESBL)如TEM和CTX-M组属于A类β-内酰胺酶。AmpCβ-内酰胺酶如CMY-2属于C类酶。肠杆菌科包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌等，携带多种β-内酰胺酶，给临床诊断和治疗带来巨大压力。

早期诊断和有效的药物治疗是解决抗生素耐药问题的关键手段。临床上迫切需要快速、准确的检测方法。较短的检测时间以及准确的诊断，有助于患者及时获得恰当的抗生素治疗。在过去的几十年中，传统的检测β-内酰胺酶的方法，如标准纸片扩散法、肉汤微量稀释法和琼脂稀释法等，耗时较长，只能确定其对哪类药物的耐药性，不能确定β-内酰胺酶的类型。以酶活性为基础的方法，如Carba-NP试验，对单一类型的碳青霉烯具有快速的特性但特异性较低。基于基因序列扩增的PCR技术已广泛应用于抗菌药物耐药基因型的检测。但由于耐药酶是基因表达的产物，基因检测的结果并不一定代表耐药酶的成功表达。此外，非特异性扩增引起的假阳性也会干扰正确诊断。

随着液质联用技术的日趋完善，LC-MS/MS逐渐成为最热门的分析手段之一。作为已经比较成熟的技术，其目前己在蛋白质分析、生化分析、天然产物分析、药物和食品分析以及环境污染物分析等许多领域得到了广泛的应用。近几年，以SRM(selected reactionmonitoring)和MRM(multiple reaction monitoring)为代表的靶向蛋白质组学逐渐应用于耐药酶检测领域。基于Orbitrap高分辨、高精度质谱的PRM(parallel reactionmonitoring,平行反应监测)技术，能够对目标肽段进行选择性检测，从而实现对目标肽段进行相对及绝对定量。随着技术的不断进步，目前PRM技术在肽段检测数目方面有大幅度提升，展现出巨大的优势。

发明内容

鉴于目前临床产耐药酶肠杆菌的诊断和治疗困难，本发明旨在应用高灵敏度、高分辨率、高精确度的蛋白质谱检测技术(Nano LC-Orbitrap Fusion Lumos)和靶向蛋白组学分析方法平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring，PRM)建立CRE、ESBL及AmpC超级细菌感染的早期、快速、准确的诊断方法，为临床产耐药酶肠杆菌的诊断和治疗提供重要依据和技术支撑。

本发明主要提供了一种快速检测肠杆菌β-内酰胺酶的方法，包括：

样品处理：挑取单个菌落，悬浮在缓冲液中，超声处理，超滤离心后去除缓冲液，然后进行膜上酶切，得到肽段；