[发明专利]一种肽链水解试剂及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种肽链水解试剂及其制备方法和应用，设计了一种肽链水解试剂及其制备方法，可以用于标记和水解多肽或氨基酸；并公开了上述肽链水解试剂在氨基酸检测方法的应用，具体为：利用肽链水解试剂水解多肽或蛋白质；旋蒸，再用水溶解并将pH调至中性；加入金属螯合剂后，离心，取上清液，得到上清液的总离子质量色谱图；提取离子峰得到选择离子质量色谱图，根据水解产物的同位素二级碎片离子不相等的特性建立关系式，得到比值；分别获得多肽或蛋白质中谷氨酸和天冬氨酸的总含量，根据比值即可计算出实际含量；优点在于可以对多肽或蛋白质中的谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸这4种氨基酸进行准确定量，偏差小于10%。

技术领域

本发明属于氨基酸检测领域，尤其是涉及一种肽链水解试剂及其制备方法和应用。

背景技术

蛋白质在人体代谢中扮演着重要的角色，蛋白质的定量测定在食品，医学和生物学中具有重要的意义。氨基酸是既含氨基(-NH₂)又含羧基(-COOH)的有机化合物的统称，是蛋白质或多肽水解的产物，蛋白质中的氨基酸进行定性定量分析也是蛋白质结构分析的基础。

目前蛋白质中氨基酸分析方法主要有酸水解法，碱水解法和酶法。酸水解法会造成谷氨酰胺和天冬酰胺的分解，色氨酸也会被破坏；碱性水解一般采用NaOH、KOH等强碱，但在该水解条件下谷氨酰胺，天冬酰胺，苏氨酸，丝氨酸，精氨酸和半胱氨酸均遭到破坏(龚天理，刘付芳，王卫，等.食品中氨基酸测试的发展[J].中国标准化，2018(S1):156-159.)；酶水解氨基酸水解往往不彻底，反应时间长，而且引入干扰。

现行的氨基酸检测方法GB5009.124-2016采用酸水解法，规定了茚三酮柱后衍生离子交换色谱仪进行食品中氨基酸的测定：将食品中的蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过可见分光光度检测器测定氨基酸的含量；但是利用酸水解法处理多肽时，谷氨酰胺和天冬酰胺，这两种具有重要营养价值和生理功能的氨基酸，会分别水解成谷氨酸(如附图1(a)所示)和天冬氨酸(如附图1(b)所示)，造成所测得的天冬氨酸和谷氨酸的实验结果有一部分是来源于天冬酰胺和谷氨酰胺，因此无法准确检测到样品中原有的谷胺酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸这四种氨基酸的真实含量，同时色氨酸在酸性条件下会被破坏，因此现行的国标法只能测定包括丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、甘氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等15种氨基酸，不能同时对含有谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸的多肽或蛋白质进行检测，因此不适用于含有谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸的多肽或蛋白质的样品的检测。

发明内容

本发明提供了一种肽链水解试剂、制备方法及将该肽链水解试剂用于氨基酸检测方法的应用，通过制备一种新型的肽链水解试剂，将肽链水解的同时对水解产物氨基酸进行O¹⁸同位素标记，再利用液相色谱-高分辨质谱联用下水解产物的同位素二级碎片离子不相等的特性，可以对多肽或蛋白质样品中的谷胺酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸进行检测，实现了对多种氨基酸的同时测定和准确定量。

为解决上述的技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种肽链水解试剂，由以下物质组成：盐酸二氧六环溶液、重氧水和二价金属氯化物溶液；其中，所述盐酸二氧六环溶液、所述重氧水和所述二价金属氯化物溶液的摩尔比为(2～4):(35～40):(0.005～0.012)，所述的肽链水解试剂中的肽链含有谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸4种氨基酸中的一种或多种。

所述盐酸二氧六环溶液中的盐酸的浓度为1.7～2.2mol/L。