[发明专利]一种指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a结合的生物传感器及其检测方法和应用在审
申请号: | 202110365781.4 | 申请日: | 2021-04-06 |
公开(公告)号: | CN113322306A | 公开(公告)日: | 2021-08-31 |
发明(设计)人: | 李昺之;张幸;锁缇莹;吉峙润;谢思盈 | 申请(专利权)人: | 南京师范大学 |
主分类号: | C12Q1/682 | 分类号: | C12Q1/682;C12Q1/6825 |
代理公司: | 南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204 | 代理人: | 柏尚春 |
地址: | 210046 *** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 指数 扩增 应和 crispr cas 12 结合 生物 传感器 及其 检测 方法 应用 | ||
1.一种指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a相结合的生物传感器,其特征在于,该传感器的DNA模板由两段相同的序列通过Nt.BstNI的酶切位点连接而成;其中,DNA模板的5’端复制出来的反义链,其临近3’端附近可以与CRISPR-Cas12a的crRNA互补配对;当样品中含有Let-7a的序列,DNA模板与Let-7a序列互补成双链,在聚合酶的作用下启动整个体系的扩增反应,在Nt.BstNI的作用下,切割出能够与CRISPR-Cas12a的crRNA互补的单链DNA,从而激活CRISPR-Cas12a的切割荧光团标记的单链DNA的能力;反之,若样品中没有Let-7a,则整个反应不发生。
2.根据权利要求1所述的指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a相结合的生物传感器,其特征在于,模板序列:5‘-AACT ATAC AACC TACT ACCT CAAA CAGA CTC AAAC TATA CAAC CTACTACC TCAA-3’;
Let-7a序列:5’-UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3’;
crRNA序列:5’-UAA UUU CUA CUA AGU GUA GAU AAC UAU ACA ACC UAC UAC CUC A-3’。
3.一种如权利要求1所述的指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a相结合的生物传感器的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)加入样品;目标物存在的情况下,在DNA聚合酶和Nt.BstNBI切刻内切酶的作用下将启动整个扩增反正反应,以实现放大信号的目的;
(2)加入与模板互补的适配体,适配体和模板的5’端附近通过碱基互补配对结合;
(3)加入DNA聚合酶和Nt.BstNBI切刻内切酶,适配体将沿着模板进行扩增,得到可以激活CRISPR-Cas12a的DNA片段;由于Nt.BstNBI切刻内切酶的切割,将新扩增出的DNA片段从模板上脱落下来,这使得扩增结果呈现出指数级的扩增;
(4)在步骤(3)得到的产物中加入CRISPR-Cas12a、crRNA、荧光标记的单链DNA以及反应缓冲液3,使用酶标仪测量其荧光强度;
(5)使用Real-Time PCR方法对步骤(1)中的样品进行检测,验证本发明的方法的准确性。
4.根据权利要求3所述的指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a相结合的生物传感器的检测方法,其特征在于,步骤(3)DNA聚合酶是在反应缓冲液1中,其中含有Tris-HCl、(NH4)2SO4、KCL、MgSO4、X-100;步骤(3)Nt.BstNBI切刻内切酶是在反应缓冲液2中,其中含有NaCl、Tris-HCl、MgCl2、BSA;步骤(4)中的反应缓冲液3含有NaCl、Tris-HCl、MgCl2、BSA。
5.根据权利要求3所述的指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a相结合的生物传感器的检测方法,其特征在于,步骤(3)中Nt.BstNBI切刻内切酶的反应混合液、模板以及含有目标物的溶液,在50-65℃的条件下,反应30-60min。
6.根据权利要求3所述的指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a相结合的生物传感器的检测方法,其特征在于,步骤(3)中的含Let-7a样品的浓度为0-100nM。
7.如权利要求1所述的指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a相结合的生物传感器在制备Let-7a诊断试剂中的应用。
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