[发明专利]一种指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a结合的生物传感器及其检测方法和应用

说明书

本发明公开了一种指数扩增反应和CRISPR‑Cas 12a结合的生物传感器及其检测方法和应用，该传感器的DNA模板由两段相同的序列，通过Nt.BstNI的酶切位点连接而成；其中，DNA模板的5’端复制出来的反义链，其临近3’端附近可以与CRISPR‑Cas12a的crRNA互补配对；当样品中含有Let‑7a的序列，DNA模板与Let‑7a序列互补成双链，在聚合酶的作用下启动整个体系的扩增反应，接着在Nt.BstNI的作用下，切割出能够与CRISPR‑Cas12a的crRNA互补的单链DNA，从而激活CRISPR‑Cas12a的切割荧光团标记的单链DNA的能力；反之，若样品中没有Let‑7a，则整个反应不会发生。

技术领域

本发明涉及一种生物传感器及其检测方法和应用，涉及一种指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a相结合的生物传感器及其检测方法和应用。

背景技术

microRNA，简写miRNA，是一类内源性、非编码的较短的RNA分子(19-23nt)。其可通过与目标mRNA结合，介导转录的抑制、mRNA的降解，在调控基因表达中扮演了重要的角色。它们在生物样品中的稳定性，对不利贮存环境的抵抗性等，使得其可作为一种生物标记物。microRNA在广泛的生物过程中发挥重要作用，包括增殖、发育、代谢、免疫反应、肿瘤发生和病毒感染。为了更好地了解这些生物分子的功能，必须对其进行检测，这对于人类疾病的早期诊断以及通过使用这些分子作为靶点发现新药具有巨大的潜力。RNA印迹技术被认定为检测microRNA的标准方法。但是该方法涉及到大量的人工操作，此外该方法耗时、耗量，非常不适合现场快速检测。Let-7a作为一种microRNA，在肿瘤等疾病的发生过程中发挥重要的调控作用，与肿瘤发生密切相关。但是该microRNAs本身的含量很低。因此，需要开发出一种具有高灵敏性、高特异性、简单、快速的检测方法。

等温酶扩增技术利用独特的DNA和RNA聚合酶，例如Phi29、Bst、Vent exo-DNA聚合酶以及T7 RNA聚合酶，最终可产生包含数十至数百个串联重复序列的单链DNA或者RNA。这种强大的扩增技术已成为生物医学研究和纳米生物技术中优良的工具。等温指数扩增技术(EXPAR)，是一种结合单链剪切和聚合酶延伸的等温扩增技术，这种技术具有很高的扩增效率。其特点在于利用特殊的切刻内切酶识别特异的碱基序列并且只剪切双链DNA中的一条链，但是EXPAR的背景信号较强。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于通过设计一种指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a相结合的生物传感器，从而放大检测信号，以提高整个检测方法的灵敏度与特异性。本发明设计的模板，包含两个对称的部位和一个缺口酶酶切位点，从而使得信号呈指数倍放大。本发明的另一个目的是提供该生物传感器的检测方法以及应用。

技术方案：本发明所述的指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a相结合的生物传感器，该传感器的DNA模板由两段相同的序列，通过Nt.BstNI的酶切位点连接而成；其中，DNA模板的5’端复制出来的反义链，其临近3’端附近可以与CRISPR-Cas12a的crRNA互补配对；当样品中含有Let-7a的序列，DNA模板与Let-7a序列互补成双链，在聚合酶的作用下启动整个体系的扩增反应，在Nt.BstNI的作用下，切割出能够与CRISPR-Cas12a的crRNA互补的单链DNA，从而激活CRISPR-Cas12a的切割荧光团标记的单链DNA的能力；反之，若样品中没有Let-7a，则整个反应不发生。

所述的指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a相结合的生物传感器，模板序列：5‘-AACTATAC AACC TACT ACCT CAAA CAGA CTC AAAC TATA CAAC CTAC TACC TCAA-3’；

Let-7a序列：5’-UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3’；

crRNA序列：5’-UAA UUU CUA CUA AGU GUA GAU AAC UAU ACA ACC UAC UAC CUCA-3’。