[发明专利]一种基于DNA水凝胶电化学发光体系的microRNA检测方法

权利要求书

1.一种基于DNA水凝胶电化学发光体系的microRNA检测方法，其特征在于：该方法具体包括以下步骤：

步骤S1：制备透明质酸-Ru@SiO₂-DNA混合组成的DNA水凝胶电化学发光体系；

步骤S2：将不同浓度的microRNA-145溶液和DSN酶溶液分别加入步骤S1制得的DNA水凝胶电化学发光体系中，进行酶切反应；反应后分别取上清液与三正丙胺、PBS缓冲液混合均匀，得到不同的混合体系，并使用电化学发光检测系统测量各混合体系的电化学发光信号值；

步骤S3：根据不同混合体系下检测到的电化学发光信号值，绘制标准曲线；

步骤S4：将待测样品加入根据步骤S1制得的DNA水凝胶电化学发光体系中，取反应后的上清液与三正丙胺、PBS缓冲液混合均匀，得到待测体系；使用电化学发光检测系统测量该待测体系的电化学发光信号值，将测得的该电化学发光信号值结合步骤S3标准曲线，则得出待测样品中microRNA-145的浓度。

2.根据权利要求1所述的一种基于DNA水凝胶电化学发光体系的microRNA检测方法，其特征在于：所述步骤S1具体操作如下：

步骤S1-1：将浓度为300～500μmol/L的DNA单链链A溶液与浓度为300～500μmol/L的DNA单链链B溶液按照体积比1：1混合，95℃退火5分钟，降至室温得到SA-SB双链杂交体系即300～500μmol/L的SA-SB溶液；

其中：

DNA单链链A的序列为：

5'-ACGAGGGAGAGGACGGACAGTTT-NH₂-3'；

DNA单链链B的序列为：

5'-TCTGTCCCTCCTCTGCCTCGTAACAACCAGCTAAGACACTGCCAAA-NH₂-3'；

步骤S1-2：:将5.7mg/mL的透明质酸溶液与10mg/mL的Ru@SiO₂溶液、步骤S1-1所得300～500μmol/L的SA-SB溶液按照体积比7：2：2混合均匀，得到第一混合液；

步骤S1-3：在第一混合液中依次加入97.6mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和23mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液，且第一混合液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与N-羟基琥珀酰亚胺溶液三者的体积比为11：1：1，混合均匀后于37℃反应15分钟得到第二混合液；

步骤S1-4：将质量分数为0.2％的聚乙烯亚胺溶液与第二混合液按体积比2：13混合均匀，之后37℃避光反应4-6小时，得到透明质酸-Ru@SiO₂-DNA混合组成的DNA水凝胶电化学发光体系。

3.根据权利要求2所述的所述的一种基于DNA水凝胶电化学发光体系的microRNA检测方法，其特征在于：步骤S1-3中采用恒温混匀仪进行混合均匀，且转速为350rpm，时间为15min；步骤S1-4中采用旋涡混匀器进行混合均匀，且转速为1500rpm，时间为1-2s。

4.根据权利要求1所述的一种基于DNA水凝胶电化学发光体系的microRNA检测方法，其特征在于：所述步骤S2具体操作如下：

步骤S2-1：将不同浓度的microRNA-145溶液分别加入到步骤S1制得的DNA水凝胶电化学发光体系中，每个反应体系中加入等量的DSN酶溶液，在41℃下进行酶切反应60-90分钟，得到上清液；且该步骤中microRNA-145溶液、DNA水凝胶电化学发光体系与DSN酶溶液的用量比为100μL：15μL：1μL；

步骤S2-2：将步骤S2-1所得的上清液与三正丙胺溶液、PBS缓冲液混合均匀，之后使用电化学发光检测系统测量其电化学发光信号值；且该步骤中上清液、三正丙胺溶液与PBS缓冲液的用量比为95μL：5μL：1mL；

其中，DSN酶溶液浓度为20～30U/mL；PBS缓冲液的浓度为10mM，pH为7.4。

5.根据权利要求4所述的一种基于DNA水凝胶电化学发光体系的microRNA检测方法，其特征在于：所述DSN酶浓度为25U/mL。