[发明专利]一种基于DNA水凝胶电化学发光体系的microRNA检测方法

说明书

本发明公开了一种基于DNA水凝胶电化学发光体系的microRNA检测方法，其借助透明质酸‑Ru@SiO₂‑DNA体系，构建了一个用于检测microRNA‑145的DNA水凝胶电化学发光体系；具体地，透明质酸链能够与SA‑SB双链杂交体系、聚乙烯亚胺共价形成DNA双交联水凝胶，MicroRNA‑145与DNA单链链B可完全互补配对，DSN酶溶液其特异性切割DNA‑RNA双链体中的DNA链，使水凝胶结构塌陷；包裹在水凝胶中的Ru@SiO₂随着水凝胶的降解逐渐游离到上清液中；因此，当microRNA‑145存在时，上清液中的Ru@SiO₂会增加，发光体系的电化学发光强度会增强，基于此可以实现对microRNA‑145的检测。本发明检测方法具有成本低廉、操作简单、检测灵敏度高的特点。

【技术领域】

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于DNA水凝胶电化学发光体系的microRNA检测方法。

【背景技术】

微小RNA(microRNA)是一组可以通过与目标信使RNA的3'非翻译区互补或部分互补，或通过翻译后编码的蛋白阻遏来调节生物学过程的内源性非编码RNA，其大小为22个碱基左右。

MicroRNA广泛参与机体的各种生命活动，包括细胞增殖、凋亡、应激以及衰老等。microRNA-145是一种已知具有肿瘤抑制功能的microRNA；研究表明，microRNA与许多疾病都具有相关性，比如翼状胬肉的严重程度、糖尿病患者的伤口愈合异常等；作为一种常见的疾病标志物以及治疗靶点，对不同样本中microRNA-145的表达水平进行检测具有很大的临床意义。

目前常用的microRNA检测手段主要有Northern blot、实时定量PCR(qRT-PCR)、测序分析等；其中Northern blot与实时定量PCR方法一般都需要进行专业的操作，提取总RNA之后再用引物进行扩增，才能进行后续的检测，操作复杂，流程繁琐，大多还需要在专业的实验室中进行即实验条件要求较高；而测序分析往往花费较高，且耗时长，需两到三月之久。因此，研究出一种操作简单、成本低廉的microRNA-145检测方法已成为临床检测所迫切需要的。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于DNA水凝胶电化学发光体系的microRNA检测的方法，其具有制备简便、易于操作、灵敏度高、且成本低廉的特点。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：

一种基于DNA水凝胶电化学发光体系的microRNA检测方法，该方法具体包括以下步骤：

步骤S1：制备透明质酸-Ru@SiO₂-DNA混合组成的DNA水凝胶电化学发光体系；

步骤S2：将不同浓度的microRNA-145溶液和DSN酶溶液分别加入步骤S1制得的DNA水凝胶电化学发光体系中，进行酶切反应；反应后分别取上清液与三正丙胺、PBS缓冲液混合均匀，得到不同的混合体系，并使用电化学发光检测系统测量各混合体系的电化学发光信号值；

步骤S3：根据不同混合体系下检测到的电化学发光信号值，绘制标准曲线；

步骤S4：将待测样品加入根据步骤S1制得的DNA水凝胶电化学发光体系中，取反应后的上清液与三正丙胺、PBS缓冲液混合均匀，得到待测体系；使用电化学发光检测系统测量该待测体系的电化学发光信号值，将测得的该电化学发光信号值结合步骤S3标准曲线，则得出待测样品中microRNA-145的浓度。

进一步地，所述步骤S1具体操作如下：

步骤S1-1：将浓度为300～500μmol/L的DNA单链链A溶液与浓度为300～500μmol/L的DNA单链链B溶液按照体积比1：1混合，95℃退火5分钟，降至室温得到SA-SB双链杂交体系即300～500μmol/L的SA-SB溶液；