[发明专利]一种CIK细胞库的构建方法

权利要求书

1.一种CIK细胞库的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)采集人外周血；

2)分离自体血浆；

3)分离外周血单个核细胞；

4)扩增培养CIK细胞；

5)CIK细胞检测；

6)CIK细胞冻存；

7)编码入库并上传细胞信息档案。

2.根据权利要求1所述的一种CIK细胞库的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中的采集人外周血是将人外周血采集至含枸橼酸钠抗凝剂的采血袋中。

3.根据权利要求2所述的一种CIK细胞库的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中的分离自体血浆的方法，包括如下步骤：

1)将采血袋中含枸橼酸钠抗凝剂的人外周血转移至50ml离心管，利用离心机进行离心；

2)离心条件：4℃，1000-2800rpm离心5-20min，离心机调节升速1-9，降速1-9；

3)取上层淡黄色液体至新的50ml离心管，置于56℃水浴锅中灭活30min后，3000-3500rpm离心3-8min收集上清得到自体血浆，置于-20℃冻存备用。

4.根据权利要求3所述的一种CIK细胞库的构建方法，其特征在于：所述步骤3)中的分离外周血单个核细胞的方法，包括如下步骤：

1)将去除自体血浆后的下层红色液体按照体积量计用生理盐水对倍稀释吹打混匀；

2)加入其0-2倍体积的0wt％-6wt％的羟乙基淀粉溶液，混匀后静置0-40min，缓慢地将20-25ml红色液体和/或上清液加入到含20ml淋巴细胞分离液的离心管中，使其与淋巴细胞分离液形成一个明显的分层；

3)利用离心机进行离心分离，离心条件：4℃，1800-5000rpm离心10-30min，离心机调节升速1-3，降速1-3；

4)吸取底部红细胞的上层所有液体并转移至新的50ml离心管中；

5)利用离心机进行离心分离，离心条件：4℃，1500-3000rpm离心3-15min，离心机调节升速6-9，降速6-9；

6)弃上清，用40ml生理盐水清洗细胞沉淀，取0.5ml细胞悬液用于细胞计数计算细胞回收率；

7)剩余细胞悬液利用离心机离心洗涤，离心条件：4℃，1500-3000rpm离心3-15min，离心机调节升速6-9，降速6-9，离心所得沉淀即为外周血单个核细胞。

5.根据权利要求4所述的一种CIK细胞库的构建方法，其特征在于：所述步骤4)的扩增培养CIK细胞的方法，包括如下步骤：

1)将获得的外周血单个核细胞接种于T175培养瓶中，补加GT-T551H3培养基，0-20％的自体血浆和终浓度为(500-1500)U/ml的IL-2、(100～1500)U/mL的IFN-γ以及(10～100)ng/mL抗CD3单克隆抗体使接种密度为1×10⁶个/ml，置于培养条件为温度36.5～37.5℃、CO₂浓度4.5～5.5％、饱和湿度条件下培养，此天设为第0d；

2)CIK细胞培养第3d开始补加GT-T551培养基、IL-2及自体血浆，其中，IL-2和自体血浆的补加量按新补充培养体系的体积计算；

3)在培养第5、7、9、11d，充分吹打悬浮细胞，收集细胞计数，根据细胞数量再补充GT-T551培养基、IL-2及自体血浆，IL-2及自体血浆补加量按新补充的培养体系的体积计算，GT-T551培养基的使用量为3L，自体血浆全部用于补液；

4)培养第14d或细胞生长至100亿后收集全部细胞并冻存。

6.根据权利要求5所述的一种CIK细胞库的构建方法，其特征在于：所述步骤5)中CIK细胞检测为在培养第12d，对CIK细胞进行支原体、细菌、内毒素、表型、细胞杀伤能力、细胞活性检测。