[发明专利]一种高迁徙间充质干细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种高迁徙间充质干细胞及其制备方法和应用。该高迁徙间充质干细胞的制备方法包括：将间充质干细胞接种混悬于间充质干细胞培养液中，在细胞培养旋转瓶或搅拌式发酵罐内进行流动液体培养，培养过程中无需添加微载体，培养结束后收集细胞球，冲洗并消化形成单细胞，即得到高迁徙间充质干细胞。本发明制备的高迁徙间充质干细胞体积小，平均直径为11～14μm，其细胞表面CXCR4表达率高达30％以上，细胞迁徙能力强，静脉注射基本不产生肺滞留现象，到达缺血心肌的数量显著增加。

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种高迁徙间充质干细胞及其制备方法和应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,or mesenchymal stromal cells,MSC)是一种具有多向分化能力的成体干细胞，能够分化形成多种组织细胞，并通过分泌大量生长和免疫调节因子，参与构成组织再生微环境，并促进组织损伤修复。间充质干细胞广泛存在于身体的多种组织，但随着年龄的增加，其数量显著减少。大量研究证明，补充间充质干细胞能够促进多种组织的再生修复。

间充质干细胞来源广泛，可分离自胎盘、脐带、骨髓等组织。由于间充质干细胞具有特殊的低免疫原性，异体间充质干细胞移植不引起免疫排异，不需组织配型，特别适合组织损伤修复(如治疗脑、心梗死等)及多种退行性疾病(如糖尿病、帕金森氏病等)的治疗，静脉注射是主要间充质干细胞移植途径。

从组织中获取的间充质干细胞数量很少，需要经过体外扩增培养后方能满足临床治疗需要。目前间充质干细胞普遍采用二维(2D)贴壁培养方法，基于生物反应器的培养过程中通常需要添加微载体共培养，例如：GE微载体(Cytopore、Cytodex、Cytoline)、明胶微载体等，细胞附着在微载体上，本质上也属于2D培养。2D培养过程中，细胞在增殖的同时发生表观遗传变化，导致诸多基因表达失常，表现为细胞体积增大，表面迁徙相关分子表达失常，如CXCR4(C-X-C Motif Chemokine Receptor4)的表达显著下降，静脉注射后有高达高达90％以上的细胞阻塞在肺微血管，其中绝大部分在24小时内因局部缺血而死亡，难以到达肺外损伤组织。也有采用三维(3D)悬滴培养，例如：WO2009134532A2公开了一种悬滴培养方式，此种方法虽然能够形成细胞聚集体，但该方法为静态培养方式，其获得的间充质干细胞CXCR4表达水平及向缺血组织的靶向迁移能力仍然存在不足。

发明内容

基于现有技术存在的缺陷，本发明的第一目的在于提供一种高迁徙间充质干细胞的制备方法；本发明的第二目的在于提供该制备方法制备获得的高迁徙间充质干细胞；本发明的第三目的在于提供该高迁徙间充质干细胞在制备治疗组织损伤修复、退行性疾病、免疫性疾病、器官移植后免疫排异、器官机能衰退、器官和组织缺血、炎症的药物中的应用。

本发明的目的通过以下技术手段得以实现：

一方面，本发明提供一种高迁徙间充质干细胞的制备方法，其包括以下步骤：

将间充质干细胞接种混悬于间充质干细胞培养液中，在细胞培养旋转瓶或搅拌式发酵罐内进行流动液体培养，培养过程中无需添加微载体，培养结束后收集细胞球，冲洗并消化形成单细胞，即得到高迁徙间充质干细胞。

发明人创造性的采用了基于三维(3D)动态细胞的培养方法，该方法将间充质干细胞接种混悬于间充质干细胞培养液中，在细胞培养旋转瓶(带有搅拌装置)或搅拌式发酵罐内进行流动液体培养，培养过程中无需添加任何微载体，能够减小间充质干细胞体积，增加其在血液循环中的移动能力和向损伤组织的迁徙能力；此外，发明人在实验中创造性地发现，细胞随液体流动，并逐步形成细胞聚集体(细胞球，spheroids)，通过搅拌引起的液体流动所产生的剪切力能够进一步显著增加间充质干细胞的迁徙能力，并显著增加间充质干细胞表面迁徙相关受体CXCR4的表达水平；在细胞聚集和流动液体形成的剪切力的双重作用促进间充质干细胞CXCR4表达和向缺血组织的靶向迁移。