[发明专利]用于检测玉米内州萎蔫病菌的特异性引物和探针及实时荧光定量PCR检测试剂盒

说明书

本发明提供用于检测玉米内州萎蔫病菌的特异性引物和探针，所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物序列为5'‑CAGGGAGATCACGGTGCCAA‑3'；下游引物序列为5'‑AGGACCCAACAGCGTGCAA‑3'；所述探针序列为：5'‑ACACACCAGACCGCGTTCCCA‑3'。本发明还提供相应的实时荧光定量PCR试剂盒。本发明的特异性引物和探针以及相应试剂盒能够用于实时荧光定量PCR检测，且所建立的方法对于玉米内州萎蔫病菌具有高敏感性、高特异性和高稳定性。

技术领域

本发明涉及用于检测玉米内州萎蔫病菌的特异性引物和探针及实时荧光定量PCR检测试剂盒。

背景技术

玉米内州萎蔫病(Goss’s Bacterial Wilt and Leaf Blight of Corn)是由执安棒形杆菌内布拉斯加亚种(Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis，Cmn)引起的一种严重的细菌性病害，可导致玉米产量损失率高达50％。该病通过种子传带进行远距离传播，目前已扩散至美国多州和加拿大部分地区，在我国尚未发现。玉米在我国的播种面积和产量均居世界第二位，而且我国大部分玉米种植区适合Cmn的发生与传播，该病菌一旦传入，将严重威胁我国粮食生产安全，因此预防和控制玉米内州萎蔫病，对确保玉米生产可持续发展具有极为重要的意义。

目前针对其检测方法主要有分离培养法、表型症状鉴定和普通PCR检测等方法。分离培养法检测方法操作复杂、耗时较长且检出效率低，不适合快速检测；田间种植表型症状鉴定结果不稳定、耗时长等；普通PCR技术灵敏度低，且无法实时鉴测PCR过程。随着分子生物学技术的不断发展，实时荧光定量PCR目前已广泛应用于菌种的检测，其与常规的分离培养和常规PCR技术相比，具有耗时短、操作简便、特异性好，且结果可直接观察，能有效避免交叉污染等优点。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了用于检测玉米内州萎蔫病菌的特异性引物和探针及实时荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒可快速、低成本、高效的检测玉米内州萎蔫病菌。本发明旨在建立一种基于QPCR技术的用于植物病菌的检测试剂盒，包括以上游引物、下游引物和荧光探针，该试剂盒所基于的序列高度保守、高度特异性，可选择性地扩增玉米内州萎蔫病菌，从而将其与常见的玉米病害其它菌种分开。基于该病菌的QPCR检测方法，具有较高的特异性、灵敏性和操作便利性等优点。

本发明提供用于检测玉米内州萎蔫病菌的特异性引物和探针，所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：

上游引物序列为5'-CAGGGAGATCACGGTGCCAA-3'；

下游引物序列为5'-AGGACCCAACAGCGTGCAA-3'

所述探针序列为：5'-ACACACCAGACCGCGTTCCCA-3'。

作为优选，所述探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM；3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。

作为优选，所述上游引物和所述下游引物为向5’端和3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。

本发明提供一种用于检测玉米内州萎蔫病菌的实时荧光定量PCR试剂盒，所述实时荧光定量PCR试剂盒包括上述的特异性引物和探针。

作为优选，在25ul PCR反应体系中，所述上游引物的用量为0.4ul，所述下游引物的用量为0.4ul，所述探针的用量为0.2ul。

作为优选，所述实时荧光定量PCR试剂盒还包括系列浓度标准品，所述标准品的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1。

本发明提供上述的特异性引物和探针、实时荧光定量PCR试剂盒在如下任一中的应用：

(1)定性检测或辅助检测玉米内州萎蔫病菌；