[发明专利]用于检测MDCK细胞残留DNA含量的特异性引物和探针及实时荧光定量PCR试剂盒

权利要求书

1.一种用于定量检测MDCK细胞残留DNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述实时荧光定量PCR试剂盒包括特异性引物和探针；

所述特异性引物为下述序列：

上游引物MDCK ND-F：5’- CATAACCAAAAGGGACGAAC -3’；

下游引物MDCK ND-R：5’- TTCCGAGGTTTATAGAGAGTTGT -3’；

所述探针序列为：5’-ACCTCACTCATTTACGCCCAC -3’。

2.根据权利要求1所述的一种用于定量检测MDCK细胞残留DNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。

3.根据权利要求1或2所述的一种用于定量检测MDCK细胞残留DNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：在20μl PCR反应体系中，所述上游引物的用量为0.4μl，所述下游引物的用量为0.4μl，所述探针的用量为0.2μl。

4.根据权利要求1或2所述的一种用于定量检测MDCK细胞残留DNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述实时荧光定量PCR试剂盒还包括阳性质粒标准品，所述阳性质粒标准品是以MDCK细胞DNA为模板，使用权利要求1中所述的引物进行PCR扩增并回收，与pMD18-T质粒进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞中诱导表达得到的。

5.根据权利要求3所述的一种用于定量检测MDCK细胞残留DNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述实时荧光定量PCR试剂盒还包括阳性质粒标准品，所述阳性质粒标准品是以MDCK细胞DNA为模板，使用权利要求1中所述的引物进行PCR扩增并回收，与pMD18-T质粒进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞中诱导表达得到的。

6.根据权利要求4所述的一种用于定量检测MDCK细胞残留DNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括Taq DNA酶、UDG酶、 dNTP、Tris-HCl、KCl、MgCl₂，空白标准品；所述空白标准品为灭菌去离子水。

7.根据权利要求5所述的一种用于定量检测MDCK细胞残留DNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括Taq DNA酶、UDG酶、 dNTP、Tris-HCl、KCl、MgCl₂，空白标准品；所述空白标准品为灭菌去离子水。

8.权利要求1-7任一所述的实时荧光定量PCR试剂盒在如下任一中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的：

（1）定性或定量检测或辅助检测MDCK细胞残留DNA含量；

（2）制备定性或定量检测或辅助检测MDCK细胞残留DNA含量的产品。

9.一种定量检测MDCK细胞残留DNA含量的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，其特征在于：分别以系列浓度的权利要求5中所述的标准品和待测样本DNA为模板，以ddH₂O为阴性对照，利用权利要求1中所述的特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，获得Ct值；以标准品的质粒浓度的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标得到标准曲线，将待测样本的Ct值代入标准曲线，获得待测样本中残留DNA含量。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的反应条件为：

Hold cycle1    污染消化  37℃  2min

               预变性    94℃  5min

Cycle cycle45  循环反应  94℃  30s

               56℃      30s

               72℃      30s   收集荧光信号。