[发明专利]用于检测MDCK细胞残留DNA含量的特异性引物和探针及实时荧光定量PCR试剂盒

说明书

本发明提供用于检测MDCK细胞残留DNA含量的特异性引物和探针，所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物MDCK ND‑F：5’‑CATAACCAAAAGGGACGAAC‑3’；下游引物MDCK ND‑R：5’‑TTCCGAGGTTTATAGAGAGTTGT‑3’；所述探针序列为：5’‑ACCTCACTCATTTACGCCCAC‑3’。本发明还提供相应的试剂盒。本发明的试剂盒能够很好的检测MDCK细胞残留DNA含量，灵敏度高，用时短。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，涉及用于检测MDCK细胞残留DNA含量的特异性引物和探针及实时荧光定量PCR试剂盒。

背景技术

生物制品的质量控制不仅是对终产品的质量控制，更是对整个生产过程的质量控制，用于生产生物技术药物的细胞基质一直因其安全性而备受关注，生产用基质细胞经历了从原代细胞，二倍体细胞到传代细胞的发展历程，人们对其潜在风险的认识也在不断变化。

细胞基质作为主要原材料，其存在的潜在危险因素包括：促生长蛋白及细胞残留蛋白、潜在病毒、细胞DNA。质量的优劣直接影响生物制品的质量和产量，尤其是生物制品的安全性。虽然至今没有因为生物制品中DNA残留量而引发不良反应或安全事故，但其用量随着临床治疗的需求越来越大，需要长期反复用药的生物制品也越来越多，同时，疫苗的使用者为健康人群，这些都使得药品监管部门更加重视生物技术产品的安全性，其中DNA残留量的质量控制一直是人们关注的热点。几十年来对于残余DNA问题的争论一直在继续，有的观点认为应将残余DNA作为一种重要危险因素，也有人倾向于将残余DNA作为一般杂质控制。各国研究机构围绕着残余DNA问题都做了大量的工作，国内外也有很多有关细胞基质及残余DNA的文献和技术指南发表。但根据现有研究结果，现在认为应将其视为一般杂质，并控制其在生物制品中的含量达到纯化工艺可控制的最低量，中国药典第3部对宿主DNA残留的要求为单次注射剂量小于10ng/剂。残余DNA的分析检测也经历了一系列的变革，很多方法被研发和革新。现有的检测手段包括DNA探针杂交法、荧光比色法、荧光定量PCR方法，因为荧光定量PCR方法灵敏度高和可定量分析等特点，应用日益广泛。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种基于实时荧光定量PCR检测MDCK残留DNA的试剂盒及检测方法。

本发明提供用于检测MDCK细胞残留DNA含量的特异性引物和探针，所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：

上游引物MDCK ND-F：5’-CATAACCAAAAGGGACGAAC-3’；

下游引物MDCK ND-R：5’-TTCCGAGGTTTATAGAGAGTTGT-3’；

所述探针序列为：5’-ACCTCACTCATTTACGCCCAC-3’。

作为优选，探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。

作为优选，所述上游引物和所述下游引物为向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。

本发明提供一种用于定量检测MDCK细胞残留DNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒，所述实时荧光定量PCR试剂盒包括上述的特异性引物和探针。

作为优选，在20μl PCR反应体系中，所述上游引物的用量为0.4μl，所述下游引物的用量为0.4μl，所述探针的用量为0.2μl。

作为优选，所述实时荧光定量PCR试剂盒还包括阳性质粒标准品，所述阳性质粒标准品是以MDCK细胞DNA为模板，使用上述的引物和探针进行PCR扩增并回收，与pMD18-T质粒进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞中诱导表达得到的。