[发明专利]一种眼镜蛇毒注射用NGF的制备方法

说明书

本发明涉及一种眼镜蛇毒注射用NGF的制备方法，将眼镜蛇粗毒进行两次凝胶层析，其中凝胶层析Ⅰ为SP‑Sephadex G‑25柱层析，凝胶层析Ⅱ为Acta Rosorse柱层析，在凝胶层析Ⅰ之前对加入缓冲液的蛇毒和凝胶层析Ⅰ后对于粗蛇毒神经生长因子液进行冷冻处理。本发明提供的眼镜蛇毒神经生长因子制备方法简单易行、可用于工业化放大生产、活性损失小，活性损失小于10％的蛇毒NGF；可以打破蛋白质分离的常规限制，使用更高初始浓度的粗蛇毒液也可以进行有效分离；生产效率高、成本合理，特别适合工业化规模生产；得率高，超过0.6％，甚至能达到0.7％以上。

技术领域

本发明涉及一种眼镜蛇毒神经生长因子的制备方法，具体涉及一种通过层析从眼镜蛇毒中分离纯化神经生长因子的方法。

背景技术

神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)、类神经生长因子是一种对多种细胞和神经元生长、发育有重要调节作用的生物活性多肽。从1984年人类发现NGF并于1986年获得诺贝尔奖，至今已经发现NGF对于维持交感神经和感觉神经细胞生长，促进神经元生长、发育、新陈代谢，维持大脑的正常机能及调节内分泌和免疫系统等方面发挥着重要的作用，是治疗脑损伤、老年性痴呆、脑膜炎、血管神经性头疼、帕金森氏综合症等与神经损伤和神经退行有关的疾病的理想药物。

神经损伤一直被认为是不可逆的损伤，而且其引起的疾病常常导致生活不能自理，生活质量严重下降，无论给患者本身还是社会都会带来沉重负担，因而国内外大药企，特别是国外药企一直在研究相关药物，NGF是其中一个重要方向。目前人体b亚基和小鼠颌下腺NGF 等多种天然基因药物国外正在进行开发研究。蛇毒中富含NGF，且我国饲养蛇古已有之，是良好的NGF来源。

从蛇毒中提取NGF的方法已经有大量研究，通常有分子筛层析、离子交换层析、亲和层析和基因工程制备等方法。分子筛层析，离子交换层析是最常用的方法，但缺点是步骤繁琐，蛋白的活性损失大。部分眼镜蛇毒NGF分离过程还要其他方法辅助。从分离介质的化学稳定性、商品的可获得性和商品成本方面考虑，具有实际用途的方法则是比较经典的、且在文献上大量使用的凝胶过滤+离子交换+凝胶过滤模式。但是这种方法存在这以下两个致命的弱点： (1)第一步的凝胶过滤过程中一般都需要100多个小时，不但操作时间长，而且蛋白与介质的长时间接触，使得所需的目标蛋白的活性有可能降低。(2)在第一步中采用的凝胶过滤法，由于凝胶介质吸附容量较小，使得样品的处理量很小，因此，只能用于实验室少量样品的制备，很难放大到中试和生产规模上。

可以说，尽管在实验室里进行了大量研究，目前仍然没有工业级别、产率高、活性损失小、生产效率高的蛇毒NGF制备方法，特别是没有可用于注射液的蛇毒NGF制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从眼镜蛇毒中提取纯化注射用NGF的方法，该方法生效效率高、NGF纯度好、收率高，可适应工业化大规模生产。

在一方面，本发明提供一种从眼镜蛇毒中提取纯化注射用NGF的方法，包括：

将眼镜蛇粗毒进行两次凝胶层析，其中凝胶层析Ⅰ为SP-Sephadex G-25柱层析，凝胶层析Ⅱ为Acta Rosorse柱层析或或Hplc Resours柱层析；在凝胶层析Ⅰ之前对加入缓冲液的蛇毒和凝胶层析Ⅰ后对于粗蛇毒神经生长因子液进行冷冻处理。

所述冷冻处理可以是选自常规冷冻、CAS冷冻、高压冷冻、磁共振冷冻技术、微波辐射冷冻、超声波冷冻、真空冷冻中的一种。优选的，所述冷冻处理选自CAS冷冻、真空冷冻、超声冷冻和微博辐射冷冻，更为优选的所属冷冻处理选自CAS冷冻、真空冷冻、超声冷冻。

所述凝胶层析的温度优选在较低的温度下进行，例如低于25℃，更优选的低于20℃，更加优选的低于10℃，还可以在更低温度，例如4℃以下进行。