[发明专利]一种多价疫苗中B型流感嗜血杆菌多糖含量的测定方法

说明书

本发明涉及一种多价疫苗中B型流感嗜血杆菌多糖含量的测定方法，所述的测定方法包括如下步骤：(1)样品预处理，包括：去佐剂：多价疫苗离心去除佐剂，取上清液样品；去保护剂：上清液样品于10kDa超滤离心管内离心后弃滤过液，去除保护剂得待水解样品；待水解样品加入盐酸水解得水解液；水解完成后，中加入NaOH中和并过滤得到供试样品；(2)色谱检测：包括：洗脱液为浓度300～400mmol/L的NaOH溶液，洗脱液流速为0.3ml/min；使用标准曲线法计算出B型流感嗜血杆菌多糖含量。

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一种多价疫苗中B型流感嗜血杆菌多糖含量的测定方法。

背景技术

DTacP-sIPV-Hib联合疫苗为含有无细胞百白破疫苗(后简称：DTacP疫苗)、脊髓灰质炎灭活疫苗(后简称：IPV疫苗)、和B型流感嗜血杆菌结合疫苗(后简称：Hib结合疫苗)的联合疫苗，其核心优势在于合并复数种单苗以提供免疫保护，显著减少了免疫接种次数。国际上通常将DTacP为基础的新型联合疫苗列为优先开发项目。由于DTacP疫苗、IPV疫苗与Hib结合疫苗的免疫程序接近，将它们制成联合疫苗并进行免疫接种可以简化接种过程并增强家长和婴幼儿接种的依从性，从而减轻疫苗管理上的困难，降低接种和管理费用。但是联合疫苗的成分较多，给检定工作增加了困难，因此寻找适合检测联合疫苗中各成分含量，同时不受其他抗原干扰的方法也成为目前的热门。

B型流感嗜血杆菌多糖含量为DTacP-sIPV-Hib联合疫苗内Hib组分的核心质控指标。目前《中华人民共和国药典》中用于B型流感嗜血杆菌多糖含量的分析方法为以核糖或磷为标示物的分光光度法，但由于DTacP-sIPV-Hib联合疫苗内包含的组分较多，诸如IPV内的三组分、糖类保护剂及磷酸铝佐剂等均会对这两种检定方法造成干扰，且分光光度法分析精度及最低检测限较低，故对联合疫苗中B型流感嗜血杆菌多糖含量的检定产生了挑战。

为避免DTacP-sIPV-Hib联合疫苗内其他组分对B型流感嗜血杆菌多糖含量的检测干扰，并提高检测灵敏度，本发明开发了一种测定DTacP-sIPV-Hib联合疫苗中B型流感嗜血杆菌多糖含量的高效阴离子色谱-脉冲安培检测方法。

发明内容

本发明涉及一种多价疫苗中B型流感嗜血杆菌多糖含量的测定方法，所述的多价疫苗为无细胞百白破疫苗-脊髓灰质炎灭活疫苗-B型流感嗜血杆菌结合疫苗五联型疫苗(DTacP-sIPV-Hib联合疫苗)，所述的测定方法包括如下步骤：

(1)样品预处理，包括如下步骤：

去佐剂：DTacP-sIPV-Hib联合疫苗置于离心机内，离心去除佐剂，取上清液样品；

去保护剂：上清液样品于10kDa超滤离心管内离心后弃滤过液后补加去离子水，去除保护剂得待水解样品；

水解：待水解样品，加入盐酸，振荡混匀，于100℃条件下水浴2小时得水解液；水解完成后，待样品冷却至室温。于水解液中加入NaOH，混匀，使用0.22μm针头滤器对水解液进行过滤，得到供试样品；

(2)色谱检测：包括以下步骤：

检测参数如下：柱温：35℃；进样体积：25μL；信号收集速率：1Hz；

洗脱液为浓度300～400mmol/L的NaOH溶液，洗脱液流速为0.3ml/min；

使用标准曲线的回归方程计算出B型流感嗜血杆菌多糖含量。

优选的，

步骤(1)所述的样品预处理步骤中，

去佐剂步骤中，DTacP-sIPV-Hib联合疫苗取样量为5-10ml；离心参数为：4℃，6500rpm，离心15min；