[发明专利]检测多子小瓜虫的Taqman探针qPCR检测引物组和应用

权利要求书

1.组织蛋白酶L基因作为分子靶点在制备检测、鉴别或诊断多子小瓜虫的试剂中的应用，其特征在于：

所述的组织蛋白酶L基因的GenBank：XM_004039979.1。

2.一种用于检测多子小瓜虫的试剂，其特征在于：包含能够检测多子小瓜虫的权利要求1中所述的组织蛋白酶L基因的引物。

3.根据权利要求2所述的用于检测多子小瓜虫的试剂，其特征在于：

能够检测多子小瓜虫的组织蛋白酶L基因的引物，序列如下：

Cathepsin F：5’-CAGGAGTTGCTTTCTTTG-3’；

Cathepsin R：5’-CTCCTTTAATTCTTTATAAGTTTTC-3’；

Cathepsin-Probe：5’-FAM-TTTCTCACCATAAAGCTCCTACACATG-BHQ3’。

4.权利要求2或3所述的用于检测多子小瓜虫的试剂在检测、鉴别或诊断多子小瓜虫的试剂盒中的应用。

5.一种用于检测多子小瓜虫的试剂盒，其特征在于：含有权利要求2或3所述的用于检测多子小瓜虫的试剂。

6.一种定量检测多子小瓜虫的方法，其特征在于：包括如下步骤：所述方法为非疾病诊断方法；

(1)提取待测样品DNA；

(2)PCR扩增组织蛋白酶L基因，构建重组质粒，以其为模板建立qPCR反应体系以及用不同拷贝数(Sq)的重组质粒的对数值及其Ct值的关系绘制标准曲线；其中，拷贝数Sq与Ct值的关系为Ct＝-3.164×lg(Sq)+36.848，相关系数R²＝0.993；

(3)利用建立好的检测方法，加入权利要求2或3所述的用于检测多子小瓜虫的试剂和待测样品DNA，配成qPCR反应体系，进行qPCR反应，得到待测样品的Ct值；

(4)多子小瓜虫定量检测

qPCR完成后，根据Ct值判断：若无扩增，则判断该样品中无多子小瓜虫；若有扩增，则根据建立好的标准曲线计算相应的组织蛋白酶L基因拷贝数，阴性对照的Ct值应无扩增。

7.权利要求6所述的方法，其特征在于：

每只多子小瓜虫的组织蛋白酶L基因拷贝数为7个拷贝数；

步骤(1)中，待测样品为水体、底泥或鱼体组织。

8.权利要求6所述的方法，其特征在于：

步骤(2)、(3)中，qPCR反应体系，为：10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol·mL^-1的氯化镁3.2μL，2.5mM四种脱氧核苷酸的混合物2μL，10μM的Cathepsin F/R各1μL，10μM的Cathepsin-Probe 0.5μL，5U/μL的Taq酶0.25μL；模板DNA 1μL，灭菌双蒸水12.55μL；反应体系总体积为24μL。

9.权利要求6所述的方法，其特征在于：

qPCR反应条件为：95℃预变性2min，然后95℃变性15s，58℃退火30s；72℃延伸20s，如此40个循环；每次都在58℃退火结束时收集荧光信号；阴性对照的Ct值应不显示。

10.权利要求6所述的方法，其特征在于：

步骤(3)中，以不同拷贝数(Sq)的重组质粒是拷贝数为5.4×10⁰～5.4×10⁹拷贝/μL的重组质粒；具体为5.4×10⁰、5.4×10¹、5.4×10²、5.4×10³、5.4×10⁴、5.4×10⁵、5.4×10⁶、5.4×10⁷、5.4×10⁸、5.4×10⁹拷贝/μL的重组质粒。