[发明专利]检测多子小瓜虫的Taqman探针qPCR检测引物组和应用

说明书

本发明公开一种检测多子小瓜虫的Taqman探针qPCR检测引物组和应用，属于寄生虫检测领域。本发明根据多子小瓜虫的靶标分子组织蛋白酶L基因序列，设计一对特异引物和一条探针。该引物和探针对多子小瓜虫亲缘关系较近的四膜虫、草履虫以及养殖水体水样和底泥均无扩增，特异性强；检测灵敏度高，检测下限为5.4拷贝/μL，约为1只多子小瓜虫，重复性好(该技术的变异系数低于5％)；方法检测方便，省去了常规PCR方法中的电泳步骤以及杜绝了传统PCR的气溶胶污染，大大节约时间和提高检测准确性；可应用于水体环境中和鱼体上的多子小瓜虫检测，为预防多子小瓜虫病，提供技术支持。

技术领域

本发明属于寄生虫检测领域，具体涉及一种检测多子小瓜虫的Taqman探针qPCR检测引物组和应用。

背景技术

多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)是世界上淡水和咸淡水鱼类的重要寄生纤毛虫，主要寄生于鱼类的鳃和皮肤，形成白点，又称白点病，该病危害大，病鱼死亡率高，造成严重经济损失。因此，防治小瓜虫病是水产养殖中的重要工作，而及时发现水体中存在多子小瓜虫是防治小瓜虫病的关键，这就需要检测水体中多子小瓜虫的检测技术。目前，国内外检测多子小瓜虫的方法主要是显微镜检查、常规PCR、荧光定量PCR，但是，这些现有检测方法要么应用范围受限，要么检测灵敏低，无法满足需求。Taqman探针荧光定量PCR技术特异性强、灵敏度高，更适合用于定量检测。因此，寻找新的靶标分子建立一种重现性好、特异性强、灵敏度高的Taqman探针荧光定量PCR方法，检测水体环境中和鱼体上的多子小瓜虫就十分必要。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种组织蛋白酶L基因在制备检测、鉴别或诊断多子小瓜虫的试剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种检测多子小瓜虫的Taqman探针qPCR检测引物组。

本发明的另一目的在于提供一种检测多子小瓜虫的Taqman探针qPCR检测试剂盒。

本发明的另一目的在于提供上述引物组或试剂盒的应用。

本发明的再一目的在于提供一种定量检测样品中多子小瓜虫的方法。

本发明提供一种Taqman探针荧光定量PCR检测多子小瓜虫的试剂盒及检测方法，特别提供一对针对多子小瓜虫的特异性引物Cathepsin F和Cathepsin R以及一条特异性探针Cathepsin-Probe，使用该试剂盒和检测方法可快速检测水环境和鱼体上的多子小瓜虫。

本发明以组织蛋白酶L(Cathepsin L，CTSL)基因为新靶标分子建立了特异灵敏的Taqman探针实时荧光定量PCR技术，并组配了该技术配套使用的试剂盒。组织蛋白酶L基因在不同物种间的相似度低，与多子小瓜虫相似度最高的嗜热四膜虫在51％的覆盖率下也只有65.07％的相似度，但多子小瓜虫之间的组织蛋白酶L基因相似度高达99.64％，这说明该基因具有种间变异大，种内保守的特点，适合用作检测靶标。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

组织蛋白酶L基因作为分子靶点在制备检测、鉴别或诊断多子小瓜虫的试剂中的应用。

优选的，所述的组织蛋白酶L基因的GenBank：XM_004039979.1。

所述的组织蛋白酶L的GenBank：XP_004040027.1。

一种用于检测多子小瓜虫的试剂，包含能够检测多子小瓜虫的组织蛋白酶L基因的引物；

具体的，以Taqman探针荧光定量PCR法为基础，针对多子小瓜虫的组织蛋白酶L基因，设计一对特异引物和Taqman探针，序列如下：

Cathepsin F：5’-CAGGAGTTGCTTTCTTTG-3’；