[发明专利]基于单个探针的自引物恒温指数扩增方法在检测长链核酸中的应用

权利要求书

1.一种长链核酸的检测方法，包括如下步骤：

(1)设计自引物扩增模板发卡，所述自引物扩增模板发卡的颈部序列长度为11～15nt；

(2)反转录待测样品RNA为待测样品DNA，以待测样品DNA为模板，与所述自引物扩增模板发卡进行等温扩增，根据扩增产物的荧光信号强度计算待测样品中的长链核酸含量；

其中，所述长链核酸为碱基长度大于1000的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述长链核酸为碱基长度大于1000的mRNA、lncRNA、RNA病毒基因组和RNA片段。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述等温扩增的反应体系为：

其中，所述10×Nt.AiwI核酸内切酶缓冲液中含有50mM CH₃COOK，20mM Tris-醋酸，10mMMg(CH₃COO)₂,，100μg/mL BSA，pH为7.9；

所述Klenow fragment(3'→5'exo-)聚合酶聚合酶缓冲液中含有10mM Tris-HCl，50mMNaCl，10mM MgCl₂，1mM二硫苏糖醇，pH为7.9。

4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述等温扩增的反应程序为：36～38℃下扩增60min。

5.根据权利要求1～4任一项所述的检测方法，其特征在于，所述长链核酸为猪瘟病毒基因组和/或其RNA片段。

6.一组自引物扩增模板发卡，其特征在于，所述自引物扩增模板发卡的核苷酸序列为：

HP-11nt：5'-CGTCCACATAGCATCTCGAGGTGGGATAGATCCGCGTAGGTACTAACCCACCTCGAGTATTCCTACGC-3'(SEQ ID NO.7)；

HP-12nt：5'-CGTCCACATAGCATCTCGAGGTGGGATAGATCCGCGTAGGTACTAACCCACCTCGAGTATTCCTACGC-3'(SEQ ID NO.8)；

HP-13nt：5'-CGTCCACATAGCATCTCGAGGTGGGACGAGACGCGTAGGTACTAACCCACCTCGAGATCCTACGC-3'(SEQ ID NO.9)；

HP-14nt：5'-CGTCCACATAGCATCTCGAGGTGGGATAGATCCGCGTAGGTACTAACCCACCTCGAGATTTCCTACGC-3'(SEQ ID NO.10)；

HP-15nt：5'-CGTCCACATAGCATCTCGAGGTGGGATAGATCCGCGTAGGTACTAACCCACCTCGAGATGCCCTACGC-3'(SEQ ID NO.11)。

7.一种检测制剂，其特征在于，所述检测制剂中含有权利要求6所述的自引物扩增模板发卡。

8.根据权利要求7所述的检测制剂，其特征在于，所述检测制剂中含有SEQ ID NO.9所示序列。

9.权利要求7或8所述的检测制剂在制备猪瘟病毒检测试剂盒中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述猪瘟病毒为含有SEQ ID NO.2所示序列的猪瘟病毒基因组或RNA片段。