[发明专利]基于单个探针的自引物恒温指数扩增方法在检测长链核酸中的应用

说明书

本发明公开了一种基于单个探针的自引物恒温指数扩增方法在检测长链核酸中的应用，其中，所述方法包括如下步骤：(1)设计自引物扩增模板发卡；(2)反转录待测样品RNA为待测样品DNA，以待测样品DNA为模板，与所述自引物扩增模板发卡进行等温扩增，根据扩增产物的荧光信号强度计算待测样品中的长链核酸含量；其中，所述长链核酸为碱基长度大于1000的核酸序列。本发明中的检测方法相比传统EXPAR，无需额外引入新的引物探针即可实现长链核酸的高灵敏高特异性检测，极大地简化了方法复杂度和降低了非特异性扩增。

技术领域

本发明是属于基因检测领域，具体涉及基于单个探针的自引物恒温指数扩增方法在检测长链核酸中的应用。

背景技术

恒温核酸扩增技术是一类在恒温条件下进行核酸扩增的技术。相比PCR技术，恒温核酸扩增无需繁琐的变温步骤，且扩增效率与PCR相当，可以广泛用于miRNA、DNA、mRNA、病毒RNA、蛋白质的检测。

恒温核酸扩增可分为无生物酶参与的扩增和基于生物酶的扩增反应。无生物酶参与的反应包括杂交链反应和催化发夹自组装反应，虽然该反应无需生物酶的参与，在一定程度上降低了成本，但是该方法扩增效率低且反应耗时长。而基于生物酶参与的恒温扩增，如滚环扩增(RCA)、环介导指数扩增(LAMP)、恒温指数扩增(EXPAR)可以在聚合酶或切口酶等生物酶的辅助下实现高扩增效率和高扩增速率，但该方法对于基于目标物触发的单个探针的扩增反应的特异性低，对于长链样品的扩增效果和效率较差，无法得到有效的推广使用。

因此，开发一种可以基于单个探针，且具有较高特异性的自引物恒温指数扩增方法对于长链核酸检测具有极为重要的意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种针对于长链核酸的基于单个探针的自引物恒温指数扩增方法，能够克服传统方法对于长链核酸(如mRNA、病毒RNA)中间保守区域几十个碱基长度的片段时，其3’端无法直接作为引物触发扩增的问题，在无需额外添加引物探针的基础上实现扩增，降低了额外引物探针的引入导致的非特异性扩增问题，简化了检测方法，实现了长链核酸高灵敏高特异性检测。

本发明的第一个方面，提供一种长链核酸的检测方法，包括如下步骤：

(1)设计自引物扩增模板发卡，所述自引物扩增模板发卡的颈部序列长度为11～15nt；

(2)反转录待测样品RNA为待测样品DNA，以待测样品DNA为模板，与所述自引物扩增模板发卡进行等温扩增，根据扩增产物的荧光信号强度计算待测样品中的长链核酸含量。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述长链核酸为碱基长度大于1000的核酸序列。

在本发明的一些优选实施方式中，所述长链核酸为碱基长度大于1000的mRNA、lncRNA、RNA病毒基因组和RNA片段。

利用常规的检测方法，如qPCR法检测长链核酸，在检测过程中，在面对长链核酸(如mRNA、病毒RNA)中间保守区域几十个碱基长度的片段时，存在3’端无法直接作为引物触发扩增的问题，其必须通过加入额外的引物探针才能实现扩增，而额外引物探针的引入容易导致非特异性扩增而且使检测方法趋向于复杂化，不利于方法的推广。而对于滚环扩增(RCA)、环介导指数扩增(LAMP)、恒温指数扩增(EXPAR)，虽然具有高扩增效率和高扩增速率的特性，但该方法对于基于目标物触发的单个探针的扩增反应的特异性低，对于长链样品的扩增效果和效率较差，无法得到有效的推广使用。