[发明专利]RNA修饰嵌合蛋白及其应用

说明书

本发明提供一种嵌合蛋白亚基，包含相互连接的(a)RNA加帽酶的D12亚基或其功能片段，或与之具有至少90％序列相同性并具有D12亚基活性的变体，和(b)RNA帽结构2′‑O‑甲基转移酶或其功能片段，或与之具有至少90％序列相同性并具有RNA帽结构2′‑O‑甲基转移活性的变体。本发明还提供包含所述嵌合蛋白亚基和RNA加帽酶D1亚基或其功能片段的嵌合蛋白。

技术领域

本发明涉及RNA合成领域，具体涉及用于修饰RNA的嵌合蛋白及其应用。

背景技术

与基于DNA的治疗剂相比，体外转录(IVT，in vitro transcription)合成mRNA在生物安全性方面具有明显优势，这归因于RNA难以整合到基因组中、RNA表达翻译蛋白的时间窗较短、不必借助于细胞内转录步骤，可以更好地控制目的蛋白的表达起始时间和表达量。

治疗用mRNA主要模拟真核mRNA天然结构，其主要特征是在5末端存在帽结构，该结构由RNA的第一个转录核苷酸连接反向7-甲基鸟苷(m7G)组成，通过一个三磷酸桥连接到第一个核苷酸上形成一个称为帽0(cap0，如图10，C所示)的结构。帽0足以招募翻译起始因子并防止mRNA降解。然后，第一个帽近端核苷酸的2′-羟基甲基化形成帽1(cap1，如图10，C所示)。Cap0帽结构主要功能包括：调节剪接；核输出；通过保护mRNA免受5’-核酸外切酶的影响从而稳定mRNA结构；辅助先天免疫识别“自身RNA”，作为招募启动因子的锚点，启动蛋白质合成以及翻译过程中mRNA的5'至3'环化。cap1结构则与先天免疫系统的识别密切相关，宿主免疫蛋白能识别异常非加帽的RNA。

因为IVT不直接产生具有生物学功能的真核带帽mRNA，只产生5'-三磷酸化RNA，所以其生成的RNA需要不同策略实现RNA的加帽修饰。目前主要有两种制备带帽mRNA的生产策略，一种是帽子类似物共转录加帽方式，一种是转录后加帽酶修饰RNA加帽方式。

在帽子类似物共转录加帽方式中，帽类似物直接添加到IVT中，具有松弛底物特异性的RNA聚合酶(例如T3，T7或SP6 RNA聚合酶)能够在转录起始时在RNA5'末端掺入帽子类似物，直接产生相应的5'帽mRNA。共转录加帽的局限性包括：GTP与帽子类似物竞争导致从IVT获得的mRNA只有部分被加帽，而且加帽/未加帽的mRNA通常难以分离和进行比例测定。用m7GpppG作为共转录帽子类似物的另一个问题是导致RNA向“错误”方向的延伸，即在m7G的3'-OH处延伸，产生的mRNA帽方向错误。

转录后加帽酶修饰RNA加帽方式指IVT生成的RNA产物在合适的反应体系中与特异性加帽酶和/或mRNA修饰酶的酶学加帽反应。cap0的酶促反应包括三个连续反应步骤：首先，5'-三磷酸酶(TPase)水解RNA的γ-磷酸；接下来，鸟苷转移酶(GTase)使用GTP作为底物将所得5'-二磷酸酯末端的β-磷酸酯与GMP偶联，形成5'-5'-连接Gppp-RNA；最后，RNA(鸟嘌呤-N7)甲基转移酶(N7-MTase)使用S-腺苷-L-蛋氨酸(AdoMet)作为底物，催化N7位甲基化帽结构。最后，m7G帽特异性2′-O-甲基转移酶(2-O-MTase)修饰了第一个核苷酸上的核糖生成cap 1结构。如图10，A所示。

截止到目前为止，尽管文献已报道了多种真核生物或病毒来源的加帽酶和mRNA修饰酶具有帽子修饰功能，但是真正能应用于大量生产制备帽结构mRNA的酶寥寥无几。本领域仍需兼具高效和低成本特性的加帽酶。

发明内容

本发明目的在于提供用于对RNA进行加帽修饰的蛋白或蛋白亚基以及用其对RNA进行修饰的方法。本发明的技术方案简化了mRNA生产相关修饰酶的生产工艺，减少mRNA生产添加原料。