[发明专利]胡芦巴蛋白及其分离提取方法和在制备骨髓HSC清除辅助剂中的应用

说明书

本发明公开了胡芦巴蛋白及其分离提取方法和在制备骨髓HSC清除辅助剂中的应用。所述胡芦巴蛋白的分离提取方法包括以下步骤：向胡芦巴提取液中缓慢加入硫酸铵至40％的饱和度，离心，收集上清液；继续加入硫酸铵至70％的饱和度，离心，收集沉淀；将沉淀透析和冷冻干燥，得到胡芦巴蛋白。本发明的胡芦巴蛋白能显著降低LSK细胞群中的G₀细胞的比例，具有增强地贫铁过载小鼠骨髓移植预处理的骨髓HSC清除功能，可用作地贫骨髓移植预处理的骨髓HSC清除辅助剂。

技术领域

本发明属于天然功能产物领域，具体涉及胡芦巴蛋白及其分离提取方法和在制备骨髓HSC(造血干细胞)清除辅助剂中的应用。

背景技术

地中海贫血是常见的遗传性血液病之一，其分子基础为珠蛋白基因缺陷导致珠蛋白链合成障碍，使形成血红蛋白四聚体的α-链/非α-链比例失衡，进而引起红细胞破坏而溶血。常规采用红细胞输注及去铁治疗。对于重型β地贫患者，骨髓移植被认为是目前唯一可以治愈的方法。

预处理是骨髓移植的重要环节之一，其主要目的是：①根除异常骨髓造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)，最大限度减少复发；②破坏患者免疫系统，为异基因HSC的植入提供条件，防止移植物被排斥；③为异基因HSC的植入提供空间。

白消安(Busulfan，Bu)具有明显的骨髓毒性，能清除骨髓中的HSC(包括多能祖细胞)，但对成熟淋巴细胞没有作用，通常与对成熟淋巴细胞具有毒性作用的药物(如环磷酰胺,Cyclophosphamide,Cy)联合，用于骨髓移植的预处理。

目前，大多数移植中心采用以Bu/Cy为基础的移植预处理方案。预处理方案中所用Bu/Cy的剂量若过大，会引起不良反应，导致病人死亡；剂量若不足，骨髓中的HSC清除不充分，则引起移植排斥或复发。因此探索新的能增强骨髓移植预处理清除骨髓HSC的辅助剂，成为提高地贫预处理效果、降低骨髓移植死亡率的重要手段之一。

胡芦巴为豆科植物胡芦巴Trigonella foenum-graecum L.的干燥成熟种子。目前对其研究主要集中在营养价值上，对其药用价值的相关研究报道较少，而关于其在清除地贫铁过载小鼠骨髓中应用的研究未见报道。

中国发明专利CN104224894B公开了胡芦巴植物蛋白大分子的制备，其将胡芦巴脱脂子叶粉分散和研磨，将所得滤液经过膜分离，制得胡芦巴植物蛋白大分子。然而该专利未明确胡芦巴植物蛋白大分子的功能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胡芦巴蛋白及其分离提取方法和在制备骨髓HSC清除辅助剂中的应用。硫酸铵饱和度40-70％(优选50-60％)下沉淀出的胡芦巴蛋白具有清除骨髓HSC的功能。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

胡芦巴蛋白的分离提取方法，包括以下步骤：

(1)将胡芦巴粉碎，先用石油醚浸泡脱脂，然后加入KH₂PO₄-NaOH缓冲液搅拌浸提4-12h，离心，取上清液；重复上述浸提操作若干次，合并所得的上清液，即为提取液；

(2)向提取液中缓慢加入硫酸铵至40％的饱和度，离心，收集上清液；继续加入硫酸铵至70％的饱和度，离心，收集沉淀；

(3)将沉淀转移至透析袋中，在去离子水中透析(平均每隔12h换一次水)，至透析液无色为止，最后将透析袋中的成分冷冻干燥，得到胡芦巴蛋白；

优选地，所述步骤(2)为：向提取液中缓慢加入硫酸铵至50％的饱和度，离心，收集上清液；继续加入硫酸铵至60％的饱和度，离心，收集沉淀；所得到的胡芦巴蛋白清除骨髓HSC的效果更好；

所述的胡芦巴为豆科植物胡芦巴Trigonella foenum-graecum L.的干燥成熟种子(购自广州清平中药材市场，经广东药科大学中药学院专家鉴定)；