[发明专利]一种底物浓度控制型时间分辨均相化学发光生物检测方法

说明书

本发明公开了一种底物浓度控制型时间分辨均相化学发光生化分析方法，包括如下步骤：(1)将催化剂和发光底物分别标记在生物识别分子上；(2)将催化剂标记的生物识别分子溶液和发光底物标记的生物识别分子溶液混合，然后加入待测物溶液，进行生物识别反应并生成复合物；(3)向反应体系中加入触发剂，通过读取特异性闪光信号强度从而对待测物进行定量分析。本发明通过控制发光底物的浓度实现了均相体系中特异性和非特异性发光信号的分离，从而减少了非特异信号的干扰，不需要洗涤步骤，提高了检测的准确性。

技术领域

本发明属于生化分析领域，涉及分析检测方法，尤其是一种均相化学发光生物检测方法。

背景技术

生化分析技术在国民经济的各个部门如食品安全、疾病诊断、环境监测等方面发挥着越来越重要的作用。近年来，生化分析领域的一个研究热点是如何在实现高灵敏检测的同时简化测定过程，这对于提高检测效率至关重要。

化学发光法具有较高的灵敏度和较宽的线性范围，在分析测试领域应用广泛。尤其是化学发光生物传感器，兼具化学发光的高灵敏度和生物识别反应的高特异性，适合复杂样品中痕量目标物的定量分析，相比于其它光学生物传感器，其设备简单，无需激发光源、光谱仪等部件，有效降低了仪器的复杂性和成本。传统的化学发光生物传感器通常是将生物识别分子修饰在固相载体(孔板、光纤、磁珠)表面，通过免疫反应或DNA分子杂交实现辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)标记的特异性识别组分的结合，在定量之前通过反复洗涤以实现结合和游离的酶标特异性识别组分的物理分离，之后引入化学发光底物，产生特异性信号。然而，上述过程需要多步洗涤，不仅增加了操作的复杂性，费时费力，而且还容易造成累积误差。

均相测定是一种无需进行分离的分析方式，检测信号的开启或关闭由特异性识别结合反应决定，反应后直接进行测定，整个过程无需洗涤等分离步骤。目前，针对基于荧光和化学发光的均相测定形式研究较多，如荧光共振能量转移(FRET)、荧光偏振、空间邻近化学发光(SPARCL)等策略，其主要依赖特异性识别结合反应导致两种生物识别分子的距离拉近，从而使得偶联在生物识别分子上的标记物发生直接或间接的相互作用，包括共振能量转移或自由基氧化还原反应，导致信号的增强或猝灭。

申请人所在的院系前期研发了一种检测有机磷农药毒死蜱的均相化学发光免疫分析方法(CN 102053162 A)，通过将鲁米诺(luminol)标记到牛血清白蛋白上，再与毒死蜱分子偶联，得到毒死蜱化学发光标记物，然后将其与毒死蜱抗体和待测物进行免疫竞争反应，向反应液中加入H₂O₂并进行化学发光测定，从而可根据化学发光信号得到待测物中毒死蜱的含量，其中，H₂O₂与鲁米诺的反应是在pH 9.6的碳酸盐缓冲液中进行，在碱性条件下，H₂O₂分解产生O₂，进而氧化luminol产生荧光。该方法能在不进行洗涤分离的均相条件下检测毒死蜱，但是也存在以下缺点：(1)检测准确性低。溶液中未参与免疫竞争反应的标记物在加入H₂O₂后也会产生非特异性检测信号，从而对复合物的检测信号产生干扰，导致检测结果不能真实反映待测物的含量。(2)化学发光反应是在碱性条件下进行，反应速率可控性差，稳定性不佳；(3)没有酶的信号放大作用，导致灵敏度低等问题。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，尤其是前期研发中所存在的缺陷，提出一种酶促均相化学发光生物检测方法，该方法通过控制化学发光底物的浓度和反应速度，从发光信号产生的时间区分特异性和非特异性检测信号，从而避免非特异性信号的干扰，提高均相检测的准确性和灵敏性。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种均相化学发光生物检测方法，该方法是基于底物浓度控制的时间分辨均相化学发光生物检测方法，包括如下步骤：

(1)将催化剂和发光底物分别标记在生物识别分子上；