[发明专利]一种均相二维可视化/荧光分析方法及应用

说明书

本发明提供了一种通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法及应用。该方法包括以3'‑端修饰叶酸的核酸链为识别探针对循环肿瘤细胞表面的生物标志物叶酸受体进行选择性识别结合；基于叶酸受体引起的位阻调控使核酸外切酶I选择性识别并切割未结合叶酸受体的叶酸修饰的核酸链，通过核酸聚合酶或延伸酶催化延伸被切割的叶酸修饰的核酸链形成核酸链模板以形成DNA模板Cu NPs或DNA模板Ag NPs，基于QDs选择性识别特性使体系引起对信号分子的信号变化得到循环肿瘤细胞的分析结果。本发明可实现基于QDs为信号分子的颜色和距离变化的二维可视化或荧光分析，在提高了检测的灵敏度和准确性的同时，为今后循环肿瘤细胞多维POCT分析奠定基础。

技术领域

本发明涉及分子诊断技术领域，尤其是涉及一种通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维化/荧光分析方法及其应用。

背景技术

目前癌症患者一旦被确诊，基本上都是中晚期，治愈的可能性及5年生存率比较低。因此对于肿瘤的早发现，其检测技术是最为核心的。现有肿瘤医学检测方法有液体活检、影像学、病理学研究等。以上方法中，液体活检在肿瘤的早发现方面是最直接和有效地。活跃生长的肿瘤通常会向外周血中释放循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells,CTCs）。越来越多的证据表明，以CTCs作为液体活检标本，对于早发现、预测复发风险、评估治疗反应和指导治疗方案，实现真正的个体化医疗具有重要意义。CTCs数目是非常稀少的，在良性疾病患者体内和正常人体内没有，在早期癌症患者体内数目稀少，且在整个癌症发展过程中均可被检测到。因此，高灵敏的CTCs检测技术对于早期癌症患者的诊断具有重要意义。

现有医学检测机构对循环肿瘤细胞（CTCs）检测方法主要是基于叶酸受体（Folatereceptor, FR）识别的免疫磁珠富集纯化、靶向探针标记和荧光定量PCR（Polymerasechain reaction）三步方法。免疫磁珠富集纯化的作用是去除红细胞和绝大多数的白细胞，同时富集CTCs。靶向探针标记是使用特异性小分子探针对FR阳性细胞进行标记，用于后续定量。荧光定量PCR是利用特异性引物，结合Taqman探针和PCR技术，对FR特异性结合的小分子探针中的寡聚核苷酸进行定量，评估样品中FR细胞水平。

然而本申请人发现就靶向探针标记和荧光定量PCR步骤而言存在以下几个问题：1、以FR为标志物，部分细胞（如肺癌细胞）对FR的表达水平较低，造成其检测的覆盖面不全；2、使用叶酸和FR识别对，捕获CTCs以及使用磁珠辅助分离，过程为非均相，操作复杂且耗时，影响检测准确性；3、使用PCR技术，需要蛋白酶且为变温过程，需要成熟的仪器和专业操作人员；4、难以实现即时检验（point-of-care testing，POCT）以及可视化读取；5、成本较高，以华西医院为例单次收费在2000元以上，且仅仅可在大型医院内完成，难以在基层医院推广以及用于患者的自我监测。因此，针对现有技术存在的问题，需要提供一种简化现有肿瘤诊断流程和操作，缩短时间、降低成本且改善分析灵敏度的分析方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法，以解决现有技术中对循环肿瘤细胞的检测方法覆盖面不全，难以实现即时检验及可视化读取的技术问题。

本发明的另一目的在于提供一种通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相可视化/荧光分析方法的应用。

本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供的一种通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法，包括以3'-端修饰叶酸的核酸链为识别探针对循环肿瘤细胞表面的生物标志物叶酸受体进行选择性识别结合；