[发明专利]一种检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法

权利要求书

1.一种检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：以全局调控因子sarA作为依赖于mRNA的反转录PCR技术的靶基因来检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌，该方法不用于疾病的诊断和治疗。

2.根据权利要求1所述的一种检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）取30 mL的待测菌液样品，在4℃条件下以8000×g重复离心多次富集菌体，加入1mL的0.85% NaCl溶液重悬；

（2）分别取1.5 mL和1 mL的对数生长期金黄色葡萄球菌液和重悬的待测菌液样品于4℃条件下，以13400×g离心2 min收集菌体；

（3）用RNase-Free ddH₂O洗涤2次，去除上清液；

（4）加入100 μL1 mg/mL的溶葡萄球菌酶于37℃恒温水浴锅中处理1 h；

（5）使用RNA提取试剂盒进行RNA的提取；

（6）使用超微量紫外可见分光光度计对RNA的提取样品进行检测，测定260 nm和280 nm吸收值；

（7）对提取好的RNA溶液进行反转录；

（8）对反转录的样品进行处理，配制 PCR 反应液，引物序列见下表1；

表1 金黄色葡萄球菌sarA基因和内参gyrB引物序列

（9）通过Step One Plus Real-time PCR系统采用两步法PCR的扩增标准程序进行扩增：第一步：预变性，95℃，30 s，重复1次；第二步：PCR反应，95℃，5 s，60℃，30 s，重复40次；

（10）以gyrB作为内参，用2^-△△CT法计算基因表达水平的倍数变化，待测菌液样品中sarA的表达和对数生长期金黄色葡萄球菌液的相比没有显著性差异，从数据分析上看，P值＞0.05，证明待测菌液样品中存在不可培养状态金黄色葡萄球菌。

3.根据权利要求2所述的一种检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：步骤（1）中，待测菌液样品中可培养菌数为0，活菌总数不为0。

4.根据权利要求2所述的一种检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：步骤（5）中，RNA的提取使用RNAprep Pure总RNA提取试剂盒并按照说明书进行，离心皆在25℃条件下操作。

5.根据权利要求2所述的一种检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：步骤（7）中，反转录过程按照Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kitwith dsDNase试剂盒说明书进行，实验全程在冰盒上进行操作。

6.根据权利要求2所述的一种检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：步骤（8）中，使用 TB Green®Premix Ex Taq^TM II 试剂盒，对反转录的样品进行处理，按下列的组份配制 PCR 反应液：TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2X）10 μL，PCR Forward Primer（10 μM）0.4 μL，PCR Reverse Primer（10 μM）0.4 μL，ROXReference Dye（50X）0.4 μL，DNA 模板2 μL，灭菌水6.8 μL，总体积20 μL，步骤（9）中，通过Step One Plus Real-time PCR 系统采用两步法 PCR 的扩增标准程序在 20 μL 的总反应体积下进行扩增。

7.根据权利要求2所述的一种检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：步骤（8）中，引物序列还包括如下表2和表3：

表2金黄色葡萄球菌pbp1基因和ebpS基因序列

表3金黄色葡萄球菌生物被膜形成相关基因序列

步骤（10）中， pbp1、ebps、icaA、icaB、icaC、icaD、fnbA、fnbB、ebh和agrA的表达水平显著低于对数生长期。