[发明专利]一种检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法

说明书

本发明涉及一种微生物检测方法，特别涉及一种检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT‑PCR)技术考察对数生长期和VBNC状态金黄色葡萄球菌中与细胞壁形成、粘附、生物被膜形成相关基因的表达变化来选择一种在VBNC状态中也高效表达的基因用于检测VBNC状态金黄色葡萄球菌，发现VBNC状态金黄色葡萄球菌sarA的表达和对数生长期金黄色葡萄球菌液的相比没有显著性差异，因此以全局调控因子sarA作为依赖于mRNA的反转录PCR技术的靶标来检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌。

技术领域

本发明涉及一种微生物检测方法，特别涉及一种检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法。

背景技术

食源性病原体可通过食物导致人类患严重疾病，金黄色葡萄球菌是重要的病原菌之一，容易污染牛奶、肉、蛋和鱼等高蛋白食品。食品中的金黄色葡萄球菌在一定条件下会产生肠毒素，导致食物中毒，由金黄色葡萄球菌引起的食品安全问题广泛存在，引起人们的广泛关注。

细菌的活的不可培养状态(Viable but nonculturable，VBNC)状态又称为活的非可培养。处于这种状态的细菌虽然不能在其常用培养基上形成菌落，但仍具有代谢活性，而且在适当条件下复苏后可以恢复到可培养状态。食源性致病菌在食品加工、贮藏过程中，受到多种因素影响，这些因素可能会诱导其进入VBNC状态。有些VBNC状态致病菌仍保留致病活性，有些VBNC状态致病菌虽然丧失致病性但复苏后致病性会随之恢复，因此VBNC状态致病菌给食品安全和质量带来隐患。

如何检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌是降低这种致病菌感染的关键之一。平板计数法常被用于微生物检测，但却无法检测到VBNC状态细菌。虽然对于VBNC状态细菌的检测仍没有标准化的方法，但分子生物学方法在检测VBNC状态细菌方面具有一定优势，比如叠氮溴化乙锭(EMA)或叠氮溴化丙锭(PMA)与聚合酶链式反应(PCR)或LAMP技术结合的检测方法，以及基于mRNA的反转录PCR法。这些方法可避免死菌带来的假阳性，因此可有效检测活的VBNC状态细菌。但现有方法操作复杂，检测灵敏度相对较低，提高对VBNC状态细菌检测的灵敏度是十分必要的，也是目前需要克服的技术障碍，因此，需要提供一种灵敏度高、操作方便的检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法，推动VBNC状态细菌检测的应用。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，提供一种检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌的方法，通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术考察对数生长期和VBNC状态金黄色葡萄球菌中与细胞壁形成、粘附、生物被膜形成相关基因的表达变化来选择一种在VBNC状态中也高效表达的基因用于检测VBNC状态金黄色葡萄球菌，发现VBNC状态金黄色葡萄球菌sarA的表达和对数生长期金黄色葡萄球菌液的相比没有显著性差异，因此以全局调控因子sarA作为依赖于mRNA的反转录PCR技术的靶标来检测活的不可培养状态金黄色葡萄球菌。

检测方法具体包括以下步骤：

(1)取30mL的待测菌液样品，在4℃条件下以8000×g重复离心多次富集菌体，加入1mL的0.85％NaCl溶液重悬；

(2)分别取1.5mL和1mL的对数生长期金黄色葡萄球菌液和重悬的待测菌液样品于4℃条件下，以13400×g离心2min收集菌体；

(3)用RNase-Free ddH₂O洗涤2次，去除上清液；

(4)加入100μL1mg/mL的溶葡萄球菌酶于37℃恒温水浴锅中处理1h；

(5)使用RNA提取试剂盒进行RNA的提取；

(6)使用超微量紫外可见分光光度计对RNA的提取样品进行检测，测定260nm和280nm吸收值；

(7)对提取好的RNA溶液进行反转录；