[发明专利]TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测试剂及方法

说明书

本发明涉及TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测试剂及方法，其中引物包括序列如SEQ ID No.1的正向引物和序列如SEQ ID No.2的反向引物；探针包括序列如SEQ ID No.3的C250T位点野生型探针、序列如SEQID No.4的C250T位点突变型探针、序列如SEQ ID No.5的C228T位点野生型探针和序列如SEQ ID No.6的C228T位点突变型探针；C250T位点野生型探针和C228T位点野生型探针的5’端标记有FAM荧光基团，C250T位点野生型探针和C228T位点野生型探针的3’端标记有MGB淬灭基团；C250T位点突变型探针和C228T位点突变型探针的5’端标记有VIC荧光基团，C250T位点突变型探针和C228T位点突变型探针的3’端标记有MGB淬灭基团。本发明能够实现TERT基因启动子突变的实时荧光定量PCR检测，检测速度快，判断方便，检测敏感性好，对检测样本要求低。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测试剂及方法。

背景技术

TERT(telomerase reverse transcriptase，端粒酶逆转录酶)基因是端粒酶起作用的关键结构和主要调控亚单位，通过逆转录端粒酶RNA模板序列，合成端粒DNA重复序列并添加到染色体末端，从而弥补了端粒在细胞分裂中的消耗。研究表明，TERT基因启动子突变参与黑色素瘤、脂肪瘤、甲状腺癌、肝细胞瘤、神经胶质瘤等多种肿瘤的发生和发展过程。TERT基因启动子突变主要发生在C250T和C228T两个位点上，两个位点均发生了胞嘧啶核苷酸c被胸腺嘧啶核苷酸t置换的点突变，两个位点的突变会增加TERT启动子的转录活性，使TERT表达上调，使得肿瘤细胞能够突破分裂周期的限制，因此促进肿瘤的发生和发展。

目前，TERT基因启动子突变常用的检测方法是Sanger测序法，Sanger测序法的原理是在作为扩增原料的四种脱氧核苷酸(dNTP)中混入限量的缺少延伸所需3’-OH基团的双脱氧核苷酸(ddNTP)作为链终止剂，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处结束，然后对所得的一系列核苷酸进行电泳检测，从而获得可见的DNA碱基序列。但Sanger测序法对组织要求高，操作复杂，敏感性仅为10～20％，容易检测失败或造成污染。

聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增DNA或RNA的分子生物学技术，具有扩增速度快等优点。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR步骤通常包括：双链模板DNA解离呈单链，单链与引物配对结合，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，按碱基互补配对和半保留复制原理，合成新的与模板DNA链互补的半保留复制链，如此重复循环能够将基因扩增放大几百万倍目前也存在利用PCR进行基因突变检测的方法，但大多检测敏感性不高，现有技术中一些文献公开了采用巢式PCR来提高检测敏感性，但巢式PCR操作复杂，且容易放大污染，对检测样本要求高；一些文献采用PCR-Sanger法进行测序，但这种方法操作麻烦，成本高。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供TERT基因启动子突变实时荧光定量PCR检测试剂及方法，能够实现TERT基因启动子突变的实时荧光定量PCR检测，检测速度快，判断方便，检测敏感性好，对检测样本要求低，成本低。