[发明专利]高效合成麦角硫因的工程菌的构建方法与应用

说明书

本发明公开了高效合成麦角硫因的工程菌的构建方法与应用，属于代谢工程领域。本发明将麦角硫因合成基因egtBCDE与异源的麦角硫因合成途径酶egt1组合，同时表达大肠杆菌基因gshA的同工酶egtA，获得工程菌E1‑A1，使麦角硫因产量由70.87mg/L提高至125.8mg/L。在工程菌E1‑A1的基础上，进一步对宿主的组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸代谢改造，构建得到基因工程菌在摇瓶条件下，麦角硫因的产量进一步提高到244.97mg/L；将其接种至3L发酵罐进行分批补料发酵，培养108h，即可使发酵液中麦角硫因的产量高达1102.96mg/L。本发明提供了一种从改造各个氨基酸前体的代谢途径来提高麦角硫因产量的思路，且构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及高效合成麦角硫因的工程菌的构建方法与应用，属于代谢工程领域。

背景技术

麦角硫因(Ergothioneine，ERG)是一种由组氨酸衍生而来的天然氨基酸衍生物，是一种硫醇化合物。麦角硫因作为一种天然抗氧化剂被广泛应用于食品、医药以及化妆品等领域。

目前，麦角硫因的生产方法主要有，提取法：从含有麦角硫因的植物、微生物中分离提取，但由于其中麦角硫因的含量较低，利用此方法制备得到的麦角硫因杂质多、成本高、产出比低，难实现工业化生产；化学合成法：原料2-巯基咪唑很难制备，合成过程中易发生外消旋作用，且由于安全性难以保证，不能在食品、医药以及化妆品等领域实现广泛的应用；传统微生物合成法：利用自身能合成麦角硫因的微生物，如分枝杆菌、放线菌、蓝细菌和裂殖酵母等，直接进行发酵培养，但此方法得到的麦角硫因浓度很低。于是通过在常用改造工程菌株中异源表达麦角硫因合成途径，并通过代谢途径改造来获得高效合成麦角硫因的工程菌，极具发展前景。

但是，现有的生物法也仍存在一定的缺陷，例如，文献“Heterologous and HighProduction of Ergothioneine in Escherichia coli”中，Ryo Osawa等人构建了一株可产麦角硫因的重组大肠杆菌，将此重组大肠杆菌摇瓶发酵72h，仅可使发酵液中麦角硫因的含量达24mg/L，产量过低；文献“Gram-scale fermentative production ofergothioneine drivenby overproduction of cysteine inEscherichia coli”中，Naoyukitanaka等人在引进麦角硫因合成途径的基础上，改造部分代谢途径后，使菌株麦角硫因的产量提高到98mg/L，产量仍然偏低，不足以大规模生产。

因此，如何利用代谢工程手段调节大肠杆菌中的代谢流，提高麦角硫因的产量，实现麦角硫因的高效合成，仍是本领域亟待解决的问题。

发明内容

[技术问题]

为了提高麦角硫因的产量、实现麦角硫因的高效生产，使其适用于工业化生产。

[技术方案]

麦角硫因合成过程中，需要用到三种氨基酸前体，分别是组氨酸(His)、甲硫氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)，为了提高这三种前体氨基酸的积累，本发明对大肠杆菌进行代谢工程改造，用质粒pCDFDuet-1来过表达大肠杆菌基因组中原有的基因或突变基因，或者异源表达其他来源的基因。本发明选择了与组氨酸积累相关的谷氨酸棒杆菌来源的基因hisG以及它的突变体hisG^{G233H，T235Q}，与甲硫氨酸积累相关的大肠杆菌基因组上的基因metA、thrA，与半胱氨酸积累相关的大肠杆菌基因组上的基因nrdH、cysK和突变基因cysE^T167A，以及谷氨酸棒杆菌来源的截短基因serA^T410STOP。