[发明专利]一种重组食甲基丁酸杆菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种重组食甲基丁酸杆菌，其特征在于，所述重组食甲基丁酸杆菌通过转入含有甲醇利用途径相关基因或丁酸合成途径相关基因的质粒，获得过表达甲醇利用途径或丁酸合成途径重组菌株；所述甲醇利用途径相关基因和丁酸合成途径相关基因的核苷酸序列分别如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示。

2.基于权利要求1所述的重组食甲基丁酸杆菌的构建方法，其特征在于，重组食甲基丁酸杆菌的构建方法包括如下步骤：(1)分别构建重组质粒pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2和重组质粒pXY1-atoB/paaH/crt/bcd；(2)对重组质粒pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2和重组质粒pXY1-atoB/paaH/crt/bcd分别进行甲基化修饰的重组质粒；(3)再将分别甲基化修饰的重组质粒电转化进入食甲基丁酸杆菌，构建重组食甲基丁酸杆菌。

3.根据权利要求2所述的重组食甲基丁酸杆菌，其特征在于，所述基因matA,mtaB,mtaC2,atoB,paaH,crt,bcd的Gene ID分别为BUME_RS16910,BUME_RS16905,BUME_RS16900,BUME_RS03485,BUME_RS03475,BUME_RS03480,BUME_RS0347。

4.根据权利要求2所述的重组食甲基丁酸杆菌，其特征在于，所述重组质粒pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2的构建方法为：使用引物MT3-BamHⅠ-F/MT3-NdeⅠ-R进行PCR扩增来源于食甲基丁酸杆菌的甲基转移酶相关基因mtaA/mtaB/mtaC2，分别使用BamHⅠ和NdeⅠ双酶切扩增片段和载体pXY1，酶连后获得重组质粒pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2。

5.根据权利要求2所述的重组食甲基丁酸杆菌，其特征在于，所述重组质粒pXY1-atoB/paaH/crt/bcd的构建方法为：使用引物Tchb-HR-F/Tchb-HR-R进行PCR扩增来源于食甲基丁酸杆菌的丁酸合成相关基因atoB/paaH/crt/bcd，将载体线性化后，通过同源重组的方法连接到载体pXY1上，获得重组质粒pXY1-atoB/paaH/crt/bcd。

6.根据权利要求2所述的重组食甲基丁酸杆菌，其特征在于，将步骤1构建的重组质粒pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2和重组质粒pXY1-atoB/paaH/crt/bcd，分别以热激法转化进含有pMCljs质粒的大肠杆菌Top10感受态中，随后培养含有pMCljs和重组质粒的大肠杆菌，并提取总质粒，完成重组质粒pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2和pXY1-atoB/paaH/crt/bcd的甲基化修饰。

7.根据权利要求2所述的重组食甲基丁酸杆菌，其特征在于，将甲基化修饰的重组质粒通过电转的方式转化进食甲基丁酸杆菌中，电转程序为2200v，400Ω；在厌氧箱中以37℃培养3-4天，菌落PCR验证后获得重组菌株。

8.基于权利要求1所述的重组食甲基丁酸杆菌在甲醇发酵产丁酸上的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在平板上挑取重组食甲基丁酸杆菌的单菌落，接种至含有红霉素的1ml YTF培养基中，培养12-16h后，将离心管中的菌液全部转接至安剖瓶中，生长至OD₆₀₀为1-1.2，将菌液倒入50ml离心管中，4000rpm离心10min，弃去上清，用PB培养基重悬后以OD₆₀₀＝0.1的接种量接种至50ml PB培养基中，再加入100mM甲醇,每隔一定时间，吸取2ml菌液，离心后将上清液转移至新的离心管保存，用于高效液相色谱检测甲醇、丁酸，用2ml超纯水重悬后检测其OD₆₀₀。