[发明专利]一种重组食甲基丁酸杆菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种重组食甲基丁酸杆菌及其构建方法与应用。以食甲基丁酸杆菌为来源，构建过表达甲醇利用和丁酸合成基因工程菌，即BM/pXY1‑mtaA/mtaB/mtaC2和BM/pXY1‑atoB/paaH/crt/bcd。重组菌株对甲醇利用和丁酸合成的能力显著增强，在PB培养基中，甲醇的消耗能力分别提升了69％，14％。丁酸的产量分别提升了38％，28.6％。为进一步提高甲醇的消耗能力奠定了基础。

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种重组食甲基丁酸杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

甲醇，是一种有刺激性气味的无色透明液体。甲醇作为生物制造原料具有以下较明显的优势：甲醇并且不需要压缩和减压安全性更高，更低的运输成本；甲醇还原力高于葡萄糖，使用甲醇作为唯一的或辅助的碳源来生产包括有机酸在内的还原性化学品，则有望获得更高的产品产量。当前生产甲醇的主要方法是化学合成法，即加压催化从化石燃料而来的合成气、直接氧化甲烷、还原大气中二氧化碳和氢气来合成甲醇，由于生产甲醇的原材料丰富，建设项目大批涌现，甲醇产能持续快速增长。因此，近年来甲醇产能压力过剩等问题日益加剧。寻找一种能够将甲醇作为底物生产各种化学品的方法，对于缓解甲醇产量过剩与需求不足之间的矛盾是至关重要的。

食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)，细菌学分类为梭菌属，是一种专性厌氧革兰氏阳性芽孢杆菌。B.methylotrophicum可同时利用甲醇、CO、CO₂等碳一化合物进行发酵。当提供还原型基质时，如CH₃OH-CO₂、CH₃OH-HCOOH等，即合成丁酸。因此，食甲基丁酸杆菌作为天然利用甲醇菌株，与好氧甲基营养菌有所不同，甲醇代谢途径还原力消耗较少，主要用于代谢产物的积累，同时菌株具有对甲醇的耐受性高，代谢甲醇速率较快等优势，其发酵主要产物是羧酸、丁酸和相应的醇类等，在生物制造业上有一定研究价值。

然而，目前的研究主要集中在食甲基丁酸杆菌的发酵条件和培养基筛选等方面，并未涉及基因改造。食甲基丁酸杆菌中甲醇代谢主要分为三个模块，第一个模块为甲基转移酶系统，该系统能将甲醇的甲基转移到甲基四氢叶酸中，该模块的三个主要基因为mtaA,mtaB和mtaC2. 随后通过WLP途径的甲基分支，甲基四氢叶酸和二氧化碳被转化乙酰-CoA。随后，涉及丁酸合成途径的几个基因:atoB,paaH,crt和bcd等基因能将乙酰-CoA进一步转化为丁酸。但食甲基丁酸杆菌对甲醇消耗速率以及丁酸生产效率方面仍有进一步提高的空间。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种重组食甲基丁酸杆菌及其构建方法与应用，通过在食甲基丁酸杆菌中过表达甲醇利用途径和丁酸合成途径，提高了该菌株对于甲醇消耗能力以及丁酸合成能力。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种重组食甲基丁酸杆菌，所述重组食甲基丁酸杆菌通过转入含有甲醇利用途径相关基因或丁酸合成途径相关基因的质粒，获得过表达甲醇利用途径或丁酸合成途径重组菌株；所述甲醇利用途径相关基因和丁酸合成途径相关基因的核苷酸序列分别如SEQ NO.1和SEQ NO.2 所示。

基于上述重组食甲基丁酸杆菌的构建方法包括如下步骤：(1)分别构建重组质粒pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2和重组质粒pXY1-atoB/paaH/crt/bcd；(2)对重组质粒 pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2和重组质粒pXY1-atoB/paaH/crt/bcd分别进行甲基化修饰的重组质粒；(3)再将分别甲基化修饰的重组质粒电转化进入食甲基丁酸杆菌，构建重组食甲基丁酸杆菌。