[发明专利]阪崎肠杆菌的荧光定量PCR检测试剂盒、检测方法及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种阪崎肠杆菌的荧光定量PCR检测试剂盒、检测方法及应用。试剂盒中含有PCR扩增试剂、对照品和参考品，PCR扩增试剂中含有用于检测阪崎肠杆菌的引物和探针，引物的序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示。本发明试剂盒可以迅速定量检测阪崎肠杆菌基因，具有快速、高效、特异性强的优点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种阪崎肠杆菌的荧光定量PCR检测试剂盒、检测方法及应用。

背景技术

阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)由于对婴幼儿造成严重威胁而成为备受关注的食源性致病菌之一。阪崎肠杆菌是革兰氏阴性无芽胞杆菌，周生鞭毛、有动力、兼性厌氧菌，产黄色色素。1980年，日本微生物学家RiichiSakazakii发现该菌为新的菌种，由黄色阴沟肠杆菌更名为阪崎肠杆菌。

阪崎肠杆菌的易感人群主要为1岁以下，特别是早产、出生体重偏低、免疫力低下的婴幼儿，可引起新生儿脑膜炎、菌血症等严重疾病。脑膜炎症状表现为发热、抽搐颤抖、卤门隆起，易引起脑梗塞、脑脓肿等并发症，死亡率高达75％，及时存活也会留下严重后遗症；菌血症症状较轻，通常会低热、寒战、白细胞偏低，容易并发脓毒血症，死亡率最高达36％。阪崎肠杆菌之所以对婴儿身体健康造成严重危害，一是由于婴儿胃酸PH较成人高，阪崎肠杆菌在婴儿肠道中可以存活，二是因为婴儿血脑屏障未发育完全，阪崎肠杆菌又可进一步轻易进入脑部引发脑膜炎。

婴儿感染阪崎肠杆菌的主要渠道是婴儿配方乳粉。由于阪崎肠杆菌比大肠杆菌具有更强的耐高渗透压，可长时间生存在干燥的奶粉中，带荚膜的阪崎肠杆菌能在奶粉中存活25年之久。而且阪崎肠杆菌耐热性较强，低于70℃水冲调奶粉时，多数阪崎仍存活。因此，奶粉中即使只有极微量的阪崎肠杆菌污染(3CFU/g)，在冲调、放置过程中就可能快速大量繁殖，从而导致婴儿感染的发生。调查显示，婴幼儿配方乳粉中阪崎肠杆菌的污染具有一定的普遍性。阪崎肠杆菌污染婴幼儿乳粉主要有原材料以及工厂环境污染两种。阪崎肠杆菌在自然界环境中是广泛存在的，巴氏消毒一般都能杀灭原料中的阪崎肠杆菌。但目前婴幼儿配方乳粉的加工过程，还需在巴氏消毒后添加不得受热的配料(核苷酸等)，易于带来阪崎肠杆菌的二次污染。其次，工厂环境也容易造成奶粉的污染，曾有研究在奶粉厂的地面、干燥塔外部、空调、包装车间等地均分离出阪崎肠杆菌，证明了阪崎肠杆菌在奶粉工厂环境中的确切分布。

针对婴儿奶粉生产厂商，国际食品法典委员会在2008年发布了CAC/RCP66-2008，规定奶粉生产厂必须采取严格分区、干清洁法等措施避免阪崎肠杆菌的污染。针对消费者，WHO建议婴儿配方奶粉应该用不低于70℃的热水冲调，并且冲调好的奶应该马上喂哺，对于早产或体重低、免疫力低的高风险婴儿，应使用商业无菌的液态婴儿配方奶。针对婴儿奶粉产品，我国GB10765－2010《食品安全国家标准婴儿配方食品》中明确规定婴儿配方食品中不得检出阪崎肠杆菌(同一批次产品抽检3份样品各100g，要求均不得检出)。

因此，建立一种阪崎肠杆菌荧光定量PCR检测方法，对阪崎肠杆菌的监测、食品安全质量控制有重要意义和作用。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提供一种阪崎肠杆菌的荧光定量PCR检测试剂盒。

本发明的第二发明目的在于提供阪崎肠杆菌的检测方法。

本发明的首第三发明目的在于提供该检测试剂盒的应用。

为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为：

本发明第一方面提出一种用于检测阪崎肠杆菌的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有PCR扩增试剂、对照品和参考品，所述PCR扩增试剂中含有用于检测阪崎肠杆菌的引物和探针，所述引物的序列如SEQ ID NO:1～SEQ IDNO:2所示，所述探针序列如SEQ ID NO:3所示。