[发明专利]一种农杆菌介导的在葡萄叶片中实现外源基因瞬时表达的方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的在葡萄叶片中实现外源基因瞬时表达的方法，其特征在于包括以下步骤：

S1、农杆菌菌液的初培养

挑取含有外源基因表达载体的农杆菌单菌落，接种于3mL的含有500μL/L卡那霉素抗生素的LB液体培养基中，置于28℃、200rpm的摇床中培养1d至浑浊且无白色絮状物，得到初培养的菌液；

S2、农杆菌菌液的二次培养

将S1中得到的初培养的菌液转接至50mL的含有500μL/L卡那霉素抗生素的LB液体培养基中，再倒入150mL的锥形瓶中，置于28℃、200rpm的摇床中培养13h直至浑浊，得到二次培养的菌液；

S3、菌体收集

将S2中得到的二次培养的菌液倒入50mL的离心管中，再置于大型离心机中，5000rpm离心10min后，倒掉上清液，备用；

S4、植物浸提液的制备

在1L蒸馏水中加入MS培养基粉末4.74g和蔗糖50g，煮沸，待其冷却后用1M的NaOH调整pH值至5.70，于121℃高压灭菌后，加入2-吗啉乙磺酸、Silwet L-77和乙酰丁香酮，其中，2-吗啉乙磺酸、Silwet L-77、乙酰丁香酮的加入浓度分别为0.5g/L、200μL/L、300mg/L，制备得到植物浸提液，备用；

S5、侵染液的制备

取S4中制备的植物浸提液1mL，用移液枪吹打黏附在S3中准备的离心管底部的菌体，直至菌体完全溶解在植物浸提液中，之后继续分次加入植物浸提液重悬，并用分光光度计测定重悬后菌液的OD₆₀₀值，直至OD₆₀₀＝0.6～0.8；

S6、样品处理

取生长发育状况良好的葡萄植株的嫩叶叶片作为样品，用次氯酸钠浸泡叶片2min，后用蒸馏水反复冲洗叶片表面直至将次氯酸钠清洗干净，之后用针尖在叶片上穿刺出50个小孔；

S7、农杆菌的侵染

将S5中制备的侵染液倒入烧杯内，将烧杯置于真空容器中，再将S6中处理好的叶片浸入烧杯内的侵染液液面以下，在-70kPa真空下真空渗透10min，使菌液渗入叶肉组织；然后取出叶片，用无菌水漂洗叶片三次，即实现了外源基因在葡萄叶片中的瞬时表达。