[发明专利]一种农杆菌介导的在葡萄叶片中实现外源基因瞬时表达的方法

说明书

本发明公开了一种农杆菌介导的在葡萄叶片中实现外源基因瞬时表达的方法，包括以下步骤：农杆菌菌液的初培养、农杆菌菌液的二次培养、菌体收集、植物浸提液的制备、侵染液的制备、样品处理、农杆菌的侵染。本发明方法通过特殊的农杆菌菌液、植物浸提液、侵染液制备，同时对葡萄叶片进行穿刺和真空侵染处理，在葡萄叶片上制造大量受伤部位，受伤处的细胞会分泌大量酚类物质，从而促使农杆菌向受伤细胞移动，大幅度提高目标基因的转化效率，为葡萄瞬时表达体系的研究及葡萄分子育种奠定了基础，与现有的农杆菌侵染方法相比，具有侵染效率和转化效率高等优点，同时适用面更加广泛，适用于包括葡萄叶片在内的大多数植物叶片。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是一种农杆菌介导的在葡萄叶片中实现外源基因瞬时表达的方法。

背景技术

瞬时表达技术是在相对较短的时间内将目的基因导入到靶细胞中，在细胞内建立暂时高效的表达系统的技术。与稳定表达相比，瞬时表达所需时间短，不需要将外源基因整合到宿主细胞的染色体中，也能在细胞内建立起暂时高效的表达系统。由于其具有操作简单、成本低、周期短、转化效果好等优点，已被国内外众多学者广泛应用。其中，农杆菌介导的瞬时表达最为普遍。

瞬时表达近年来在国内外已被应用于多种植物的研究和应用开发，从农作物的小麦(Triticum monococcum)、玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)，到园艺观赏植物的矮牵牛(Petunia hybrida)、长春花(Catharanthus roseus)、香蒲(Typha orientalis)等以及藻类植物绿藻等都已建立了相应的瞬时表达体系，为其基因功能研究和利用提供了便利。

葡萄(Vitisvinifera.L)作为多年生木质藤本植物，是世界上最古老、分布最广的三大栽培果树之一。葡萄味道甜美，香味浓郁，具有很高的营养和药用价值，因此深受人们的喜爱。目前对于葡萄的生理生化研究已较为深入，但由于葡萄叶片表面含有一层致密的角质化表皮且伴有大量茸毛，非常不利于农杆菌与植物细胞相接触，无法进一步将目的基因转入到葡萄叶片细胞中，使得转化效率低，这对于葡萄瞬时表达体系的研究及葡萄分子育种是不利的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种侵染效率和转化效率高的农杆菌介导的在葡萄叶片中实现外源基因瞬时表达的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种农杆菌介导的在葡萄叶片中实现外源基因瞬时表达的方法，包括以下步骤：

S1、农杆菌菌液的初培养

挑取含有外源基因表达载体的农杆菌单菌落，接种于3mL的含有500μL/L卡那霉素抗生素的LB液体培养基中，置于28℃、200rpm的摇床中培养1d至浑浊且无白色絮状物，得到初培养的菌液；

卡那霉素抗生素(kan)在LB液体培养基中起到抑制杂菌、筛选含重组载体细胞的作用；

S2、农杆菌菌液的二次培养

将S1中得到的初培养的菌液转接至50mL的含有500μL/L卡那霉素抗生素的LB液体培养基中，再倒入150mL的锥形瓶中，置于28℃、200rpm的摇床中培养13h直至浑浊，得到二次培养的菌液；

S3、菌体收集

将S2中得到的二次培养的菌液倒入50mL的离心管中，再置于大型离心机中，5000rpm离心10min后，倒掉上清液，备用；

S4、植物浸提液的制备

在1L蒸馏水中加入MS培养基粉末4.74g和蔗糖50g，煮沸，待其冷却后用1M的NaOH调整pH值至5.70，于121℃高压灭菌后，加入2-吗啉乙磺酸、Silwet L-77和乙酰丁香酮，其中，2-吗啉乙磺酸、Silwet L-77、乙酰丁香酮的加入浓度分别为0.5g/L、200μL/L、300mg/L，制备得到植物浸提液，备用；