[发明专利]原位检测凋亡细胞的方法

说明书

本发明提供了一种原位检测凋亡细胞的方法,包括以下步骤：步骤1，将发卡DNA用标记物进行标记，所述发卡DNA为成对的；步骤2，将标记的发卡DNA与需要检测的组织切片进行杂交链反应；步骤3，用显微镜检测步骤2中进行杂交链反应后的组织切片。本发明能够快速、经济地原位检测凋亡细胞的DNA片段，并且能够检测出比TUNEL法更多的凋亡细胞，且是更早期的凋亡细胞，而且染色处理时间与经典TUNEL法相同，与经典TUNEL法一样快速。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种原位检测凋亡细胞的方法。

背景技术

目前原位检测凋亡细胞的DNA片段的方法只有TUNEL法，如图1所示，它的检测原理是断裂DNA有3'-OH末端，在脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下，这些游离的3'-OH末端可被带标记物dUTP标记，然后用显微镜检测[Gavrieli et al，1992；Gorczyca et al，1992，Majtnerováand2018]。目前TUNEL试剂最经典、受广泛研究者喜爱的是Roche公司的，目前也有国产TUNEL试剂盒。但是，TUNEL检测试剂价格昂贵，一定程度上阻碍了研究人员的使用。

发明内容

本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种成本低、能够快速检测出凋亡细胞的DNA片段，能够检测出比TUNEL法更多的凋亡细胞且是更早期的凋亡细胞的原位检测凋亡细胞的方法。

本发明提供了一种原位检测凋亡细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，将发卡DNA用标记物进行标记，所述发卡DNA为成对的；

步骤2，将标记的发卡DNA与需要检测的组织切片进行杂交链反应；

步骤3，用显微镜检测步骤2中进行杂交链反应后的组织切片。

本发明的原理如图2所示，由于片段化DNA末端都会产生长短不一的单链DNA序列，我们设计理念是利用这些单链DNA序列来启动发卡DNA，一个发卡DNA被启动后，这些发卡就会自动聚合成高分子量的双链DNA，这一过程称为杂交链反应(hybridization ChainReaction，HCR)，直至所有发卡用尽[Choi et al，2014]。

参考文献：

Choi,H.M.,Beck,V.A.and Pierce,N.A.(2014).Next-generation in situhybridization chain reaction:higher gain,lower cost,greater durability.ACSNano 8,4284-94.

Gavrieli,Y.,Sherman,Y.and Ben-Sasson,S.A.(1992).Identification ofprogrammed cell death in situ via specific labeling ofnuclear DNAfragmentation.J Cell Biol 119,493-501.

Gorczyca,W.,Bruno,S.,Darzynkiewicz,R.,Gong,J.and Darzynkiewicz,Z.(1992).DNA strandbreaks occurring during apoptosis-their early insitudetection by the terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translationassays and prevention by serine protease inhibitors.Int J Oncol 1,639-48.