[发明专利]一种改进型pSFV1载体及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种改进型pSFV1质粒，其特征在于，所述质粒具有如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的一种改进型pSFV1质粒的构建方法，其特征在于，将pSFV1载体上的SP6启动子更换为T7启动子，并在T7启动子之前添加了CMV真核启动子，同时在载体上的SpeI酶切位点处添加SV40 poly(A)信号，所述SV40 poly(A)信号的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述CMV真核启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述T7启动子的核苷酸序列包含在如SEQ ID NO:3所示和如SEQ ID NO:4所示的核苷酸片段内。

3.根据权利要求2所述的一种改进型pSFV1质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、分别扩增获得如SEQ ID NO:1所示的片段1，如SEQ ID NO:2所示的片段2，如SEQ IDNO:3所示的片段3，如SEQ ID NO:4所示的片段4；

S2、对pSFV1载体进行酶切，使pSFV1载体线性化；

S3、将片段1连接到酶切后的pSFV1质粒上；

S4、将连接片段1后的pSFV1质粒转化进感受态细胞，并挑取单菌落进行菌液PCR鉴定获取转化成功的菌株，对菌株进行抽提质粒后获得包含片段1的质粒pSFV1-S；

S5、对pSFV1-S载体进行双酶切，使pSFV1-S载体线性化；

S6、将片段2、片段3、片段4连接到线性化的pSFV1-S质粒上，经转化、菌株鉴定、质粒抽提后得到改进型pSFV1质粒。

4.根据权利要求3所述的一种改进型pSFV1质粒的构建方法，其特征在于，扩增片段1和片段3采用pCAGGS载体为模板，扩增片段2和片段4采用pSFV1载体为模板。

5.根据权利要求4所述的一种改进型pSFV1质粒的构建方法，其特征在于，扩增片段1所用的引物如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；扩增片段2所用的引物如SEQ ID NO:7和SEQID NO:8所示；扩增片段3所用的引物如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；扩增片段4所用的引物如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。

6.根据权利要求3所述的一种改进型pSFV1质粒的构建方法，其特征在于，步骤S2为采用SpeⅠ酶对pSFV1载体进行酶切。

7.根据权利要求3所述的一种改进型pSFV1质粒的构建方法，其特征在于，步骤S4所述感受态细胞为Stbl3感受态细胞。

8.根据权利要求3所述的一种改进型pSFV1质粒的构建方法，其特征在于，步骤S5为用SphⅠ酶和EcoR V酶对pSFV1-S载体进行双酶切。

9.权利要求1所述的改进型pSFV1质粒在构建mRNA疫苗中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述mRNA疫苗为具有体外转录功能的自扩增性mRNA疫苗。