[发明专利]一种改进型pSFV1载体及其制备方法与应用

说明书

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种改进型pSFV1载体及其制备方法与应用，本发明通过将pSFV1载体上的SP6启动子更换为T7启动子，并在T7启动子之前添加了CMV真核启动子，同时在载体上的Spe I酶切位点处添加SV40poly(A)signal，构建得到一种改进型pSFV1载体，与pSFV1载体相比，本发明的改进型pSFV1载体在体外合成RNA时可以使用T7RNA聚合酶，并且可在体外转录之前检测mRNA体外转录模板是否构建成功，应用于构建mRNA疫苗，不仅可以降低成本，而且使用起来更方便高效。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种改进型pSFV1载体及其制备方法与应用。

技术背景

mRNA疫苗领域正在飞速发展，现阶段mRNA疫苗已经在流感病毒、埃博拉病毒、新型冠状肺炎病毒等传染病上取得了一定的研究成果，mRNA疫苗的作用机制是直接将mRNA递送进细胞，使宿主通过自身细胞，在体内表达目的蛋白，其过程与病毒蛋白表达过程类似，可以同时激活机体的细胞免疫及体液免疫系统。相比传统的灭活疫苗，mRNA疫苗的研发和生产速度更快，而且mRNA疫苗也表现出优秀的安全性，由于mRNA是非感染性、非整合性平台，因此没有感染或插入诱变的潜在风险。

pSFV1载体是基于塞姆利基森林病毒复制子的表达系统，该载体结构主要包含原核复制起始位点、氨苄抗生素抗性基因、SP6启动子和塞姆利基森林病毒4个非结构基因(pSFV1质粒图谱见图1)；当前，pSFV1载体被广泛应用于构建自扩增型mRNA疫苗，使用该载体为模板的mRNA疫苗在动物试验中取得了较好的结果，对比非自扩增mRNA疫苗，使用该载体构建模板体外合成的自扩增mRNA疫苗在免疫用量上更少，疫苗在体内表达时间更持久，对动物的保护效果更强。但是，该载体还存在两个缺点：第一是该载体使用了SP6启动子，由于RNA聚合酶对启动子识别的特异性，使用SP6启动子，使得以该载体为模板的体外RNA合成必须使用SP6 RNA聚合酶。然而，与SP6 RNA聚合酶相比，T7 RNA聚合酶在体外合成长片段RNA时更具有优势，而且在价格上，T7 RNA聚合酶更低廉。另一个是由pSFV载体构建的转录模板需要先转录成mRNA后才能通过体外转染鉴定模板是否可用，操作较繁琐。因此，有必要对pSFV载体进行改进，使其适用于T7 RNA聚合酶，且用于构建转录模板时可直接进行体外转染即可鉴定模板是否可用。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术中的问题，提供一种改进型pSFV1载体及其制备方法与应用，使pSFV载体在用于构建mRNA疫苗时，成本更低廉，可直接通过体外转染鉴定模板是否可用，使用起来更方便高效。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明的第一个目的是提供一种改进型pSFV1质粒，所述质粒具有如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列，所述质粒命名为pSFV1-CTS质粒，其结构图谱见图4。

本发明的第二个目的是提供上述改进型pSFV1质粒的构建方法，即将pSFV1载体上的SP6启动子更换为T7启动子，并在T7启动子之前添加了CMV真核启动子，同时在载体上的Spe I酶切位点处添加SV40 poly(A)信号，所述SV40 poly(A)信号(SV40 poly(A)signal)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述CMV真核启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述T7启动子的核苷酸序列包含在如SEQ ID NO:3所示和如SEQ ID NO:4所示的核苷酸片段内。

作为本发明的一个优选实施方式，上述改进型pSFV1质粒的构建方法包括以下步骤：

S1、分别扩增获得如SEQ ID NO:1所示的片段1(即SV40 poly(A)信号)，如SEQ IDNO:2所示的片段2，如SEQ ID NO:3所示的片段3(即CMV真核启动子)，如SEQ ID NO:4所示的片段4；

S2、对pSFV1载体进行酶切，使pSFV1载体线性化；