[发明专利]具核梭杆菌荧光定量检测试剂盒及其制备方法与检测方法

权利要求书

1.一种具核梭杆菌荧光定量检测试剂盒，其特征在于：包括第一试剂、第二试剂、第一反应液、第二反应液、定量参考品、临界阳性对照、强阳性对照与阴性对照，所述第二反应液包括特异性扩增具核梭杆菌基因与细菌16S rDNA基因的引物及探针溶液。

2.如权利要求1所述的一种具核梭杆菌荧光定量检测试剂盒，其特征在于：所述第一试剂为样品保存液，所述样品保存液包括0.01-1mol/L的EDTA、0.01-3mol/L的Tris-HCl、0.05-0.5mol/L的NaCl、质量分数为0.1％-0.5％的SDS、浓度为0.01-0.5M的柠檬酸钠、10-50％的无水乙醇中的一种或多种组合而成。

3.如权利要求1所述的一种具核梭杆菌荧光定量检测试剂盒，其特征在于：所述第二试剂为核酸提取液，所述核酸提取液包括100-500mM Tris-HCl、20-100mM EDTA、0.4-1M NaCl与体积分数为1％-4％的SDS，所述Tris-HCl的pH7.4，所述EDTA的pH7.4。

4.如权利要求1所述的一种具核梭杆菌荧光定量检测试剂盒，其特征在于：所述第一反应液为酶反应液，所述酶反应液包括PCR反应缓冲液、dNTPs、tTH酶、UNG酶、BSA、甜菜碱、DMSO和Mg2+中的一种或多种组合而成。

5.如权利要求1所述的一种具核梭杆菌荧光定量检测试剂盒，其特征在于：所述临界阳性对照与强阳性对照分别包括灭活的具核梭杆菌标准菌株，强阳性对照浓度为10⁸CFU/ml；临界阳性对照浓度为500-1000CFU/ml；阴性对照包括非具核梭杆菌样本DNA溶液；定量参考品包括检测靶基因核苷酸序列的DNA片段质粒，其标准品浓度分别为4×10⁷copies/ml、4×10⁶copies/ml、4×10⁵copies/ml、4×10⁴copies/ml、4×10³copies/ml。

6.一种特异性扩增具核梭杆菌的核酸组合引物及其探针的制备方法，其特征在于：依据NCBI数据库中相应的细菌核酸序列，设计具核梭杆菌与细菌16SrDNA引物与探针，引物长度18-25bp，避免产生二级结构，引物GC含量为40-60％，Tm值50-60℃；依据上下游引物所扩增的产物序列选择20-28个碱基片段作为探针区域，避免产生二级结构；引物GC含量为50-60％，Tm值55-65℃；所述具核梭杆菌的核酸组合中的引物组合包括第一引物对与第二引物对，所述第一引物对的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述第一引物对的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，所述第二引物对的上游引物碱基序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二引物对的下游引物碱基序列如SEQ ID NO.4所示。

7.如权利要求6所述的一种特异性扩增具核梭杆菌的核酸组合引物及其探针的制备方法，其特征在于：所述具核梭杆菌的核酸组合中的探针包括第一探针与第二探针，所述第一探针与第二探针的5'端标记有荧光基团，探针3'端标记有淬灭基团，所述探针的5'端标记有荧光基团，3'端标记有淬灭基团，所述荧光基团为FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXAS RED、RED670、NED中的其中一种，所述淬灭基团为6-TAMRA、BHQ-1～3与结合分子沟的非荧光淬灭剂其中的一种。

8.如权利要求7所述的一种特异性扩增具核梭杆菌的核酸组合引物及其探针的制备方法，其特征在于：所述第一探针的序列如SEQ ID NO.5所示，所述第二探针的序列如SEQ IDNO.6所示。