[发明专利]具核梭杆菌荧光定量检测试剂盒及其制备方法与检测方法

说明书

本发明公开了具核梭杆菌荧光定量检测试剂盒及其制备方法与检测方法，包括第一试剂、第二试剂、第一反应液、第二反应液、定量参考品、临界阳性对照、强阳性对照与阴性对照，所述第二反应液包括特异性扩增具核梭杆菌基因与细菌16S rDNA基因的引物及探针溶液，本发明提供的具核梭杆菌检测试剂盒能够检出多种类型临床样本中的具核梭杆菌，且具有较高的灵敏度和特异性，可便捷地应用于临床多种场景，有效提高检测效率；还可对具核梭杆菌进行定量检测，且操作简单，利于推广应用。

技术领域

本发明涉及医学临床技术领域，具体为一种具核梭杆菌荧光定量检测试剂盒及其制备方法与检测方法。

背景技术

具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,Fn)是一种广泛存在于人体和多种动物体内的无芽孢专性厌氧杆菌。过去Fn一直被视为人体口咽部的正常菌群之一，近年来从临床标本中被分离出来，已被证实为一种条件致病菌，其不仅与口腔疾病有关，还有败血症、盆腔炎、食管癌、结直肠癌等疾病有密切关系。特别是结直肠癌(CRC)，作为全球第三大常见肿瘤，是引起肿瘤相关死亡的第二大病因，其发生、发展、分子分型、患者化疗后反应、预后等都与具核梭杆菌密切相关：结直肠癌患者的肿瘤组织及粪便中，具核梭杆菌的丰度显著升高；具核梭杆菌能够通过诱导癌细胞自噬而导致CRC患者化疗耐药与肿瘤的术后复发，复发患者肿瘤组织中具核梭杆菌含量明显高于未复发患者；在检测结直肠癌及高危腺瘤时，CRC及高危腺瘤患者粪便中具核梭杆菌丰度高于健康人，结合粪便免疫化学检测(FIT)与粪便具核梭杆菌定量，可提升CRC诊断的准确性和灵敏度。具核梭杆菌可影响CRC进展中的多个阶段：促进癌细胞增殖、肿瘤免疫逃逸、复发和化疗耐药性等。因此具核梭杆菌可作为潜在的标志物用于CRC诊断和预后评估，也是治疗CRC的潜在靶点，临床上对于具核梭杆菌的鉴定和检测也得到越来越多的重视。

目前，具核梭杆菌检测方法有多种，具体可细分为细菌学、免疫学、组织病理学、分子生物学方法等。细菌学方法，即传统的微生物培养及鉴定，耗时长、效率低，特别是厌氧菌的分离培养对培养条件有着苛刻要求，极易出现假阴性。免疫学方法多依赖细菌培养的基础。组织病理学鉴定可对组织样本中的具核梭杆菌进行定位，但对样本类型、采集保存条件等要求较高。而分子生物学方法，尤其是实时荧光定量PCR(RT-qPCR或qPCR)法，因其灵敏度高，特异性强，不依赖培养，可对多种类型标本进行直接检测并同时进行定量或相对定量等优点，已成为目前检测病原微生物应用最多的手段。具核梭杆菌的荧光定量PCR检测方法及应用已得到越来越多的认可，但仍面临着挑战：不同研究团队检测的基因靶标的不一致性，导致缺少判定检测结果的统一标准，且缺少对于具核梭杆菌荧光PCR检测方法特异性、灵敏度及应用范围的专门研究。此外，目前关于具核梭杆菌的检测研究多局限于对粪便样本或结直肠癌组织样本中的具核梭杆菌进行检测，而具核梭杆菌作为口腔中的常见共生菌及条件致病菌，可引起口咽部和口腔外多种感染性疾病，因此，对口腔拭子或牙菌斑等多种临床样本中的具核梭杆菌进行检测同样具有重要的临床意义。因此急需开发出一种便捷的适用于多种临床样本的通用型具核梭杆菌检测试剂方法，从而方便检测，提高检测效率。

发明内容

本发明提供具核梭杆菌荧光定量检测试剂盒及其制备方法与检测方法。

本发明的方案是：

一种具核梭杆菌荧光定量检测试剂盒，包括第一试剂、第二试剂、第一反应液、第二反应液、定量参考品、临界阳性对照、强阳性对照与阴性对照，所述第二反应液包括特异性扩增具核梭杆菌基因与细菌16S rDNA基因的引物及探针溶液。

作为优选的技术方案，所述第一试剂为样品保存液，所述样品保存液包括0.01-1mol/L的EDTA、0.01-3mol/L的Tris-HCl、0.05-0.5mol/L的NaCl、质量分数为0.1％-0.5％的SDS、浓度为0.01-0.5M的柠檬酸钠、10-50％的无水乙醇中的一种或多种组合而成。