[发明专利]27位赖氨酸突变泛素分子增强树突状细胞交叉提呈的方法

说明书

27位赖氨酸突变泛素分子增强树突状细胞交叉提呈的方法，涉及基因工程技术领域。从小鼠骨髓中分离得到树突状细胞；用27位赖氨酸突变泛素分子预处理骨髓来源树突状细胞：先进行siRNA干扰实验，再进行体外过继免疫，最后进行酶联免疫斑点实验和免疫印迹实验。以27位赖氨酸突变为精氨酸的泛素分子处理树突状细胞，实验证明，处理后的树突状细胞可明显增强树突状细胞交叉提呈能力，并促进DC介导的抗原特异性CTL诱生能力；27位赖氨酸突变为精氨酸的泛素分子可增加树突状细胞转输受体内淋巴细胞产生穿孔素、颗粒酶B能力。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种27位赖氨酸突变泛素分子增强树突状细胞交叉提呈的方法。

背景技术

树突状细胞(Dendritic cells,DC)是机体介导适应性免疫的重要抗原提呈细胞，对于固有免疫与适应性免疫起着重要的桥梁作用。交叉提呈途径是指外源性抗原经DC作用后与MHC-I类分子形成复合体，提呈给CD8⁺T(cytotoxic T lymphocyte,CTL)细胞并使其增殖分化。CTL细胞对肿瘤、病毒感染的宿主细胞进行杀伤过程则涉及释放穿孔素(perforin)颗粒酶(granzyme B)所介导的效应有关。穿孔素是Ca²⁺依赖的疏水性分子，它能在靶细胞膜上融出通道，并进一步诱导颗粒酶进入靶细胞的细胞质中，促进靶细胞发生凋亡。由于外源性抗原的相对分子质量较大，限制其通过内源性途径对抗原进行处理，而通过交叉提呈途径提呈抗原，可起到杀伤靶细胞的作用，因此，DC交叉提呈所诱导的CTL对肿瘤及病毒的清除非常重要(Fu C,Jiang A.Dendritic cells and CD8 T cell immunity in tumormicroenvironment[J].Front Immunol,2018,9:3059.DOI:10.3389/fimmu.2018.03059)。

泛素有7个赖氨酸(Lysine,K)残基，因此，蛋白的泛素化也可根据其发生泛素化的赖氨酸位置而分为K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63等方式的泛素化(Zinngrebe J,Montinaro A,Peltzer N,et al.Ubiquitin in the immune system[J].EMBO Rep,2014,15(1):28-45.DOI:10.1002/embr.201338025)。一个完整的泛素化过程需由泛素活化酶E1、结合酶E2及连接酶E3共同完成(Swatek KN,Komander D.Ubiquitin modification[J].Cell Res,2016,26(4):399-422.DOI:10.1038/cr.2016.39)。活化酶E1在ATP催化下，将泛素的羧基端与半胱氨酸形成硫酯键、在结合酶E2作用下活化的泛素与结合酶E2半胱氨酸残基结合、再由连接酶E3催化泛素分子羧基结合到靶蛋白赖氨酸侧链上(Park Y,Jin HS,AkiD,et al.The ubiquitin system in immune regulation[J].A dv Immunol,2014,124:17-66.DOI:10.1016/B978-0-12-800147-9.00002-9)。DC交叉提呈所涉及的内吞抗原移位进入细胞质的亚细胞器定位与泛素化密切相关，前期研究发现，K48泛素化使泛素化的蛋白靶向蛋白酶体，而K63泛素化的蛋白则靶向溶酶体，K48泛素化突变使得树突状细胞交叉提呈能力减弱(Zehner M,Chasan AI,Schuette V,et al.Mannose receptor poly-ubiquitination regulates endosomal recruitment of p97 and cytosolic antigentranslocation for cross-presentation[J].PNAS,2011,108:9933-9938.DOI:10.1073/pnas.1102397108)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种27位赖氨酸突变泛素分子增强树突状细胞交叉提呈的方法。

本发明包括以下步骤：